概要

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

Published: May 05, 2022
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概要

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。

Abstract

アクチンフィラメントの組み立てと分解を調節する複雑な分子メカニズムを解読するために、よく制御された条件下で個々の反応を監視することは大きな資産です。そのために、過去20年間に全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた生きたシングルフィラメント実験が登場し、重要な結果をもたらしました。2011年には、これらの実験の可能性をさらに広げ、繰り返し発生する問題のあるアーティファクトを回避するために、これらのアッセイに単純なマイクロフルイディクスを導入しました。この研究は、個々のアクチンフィラメントが不動態化されたカバースリップ表面に一端で固定され、流れに整列し、異なるタンパク質溶液に連続的に曝露され得るという、我々の基本的なプロトコルを詳述する。また、特定のアプリケーション向けのプロトコルを提示し、流れる溶液の粘性抗力のおかげで、制御された機械的力を適用する方法について説明します。我々は、これらの実験の技術的注意点を強調し、この技術に基づいて可能な開発を簡単に提示する。これらのプロトコルと説明は、使いやすいマイクロフルイディクス装置の今日の可用性とともに、非専門家がラボでこのアッセイを実施できるはずです。

Introduction

アクチンフィラメントおよびアクチンフィラメントネットワークの組み立ておよび分解は、いくつかの生化学反応によって制御され、機械的文脈に依存する。これらの複雑なメカニズムについての洞察を得るためには、個々のフィラメント上の個々の反応を(十分に多数で)観察できることは非常に貴重です。過去数十年にわたり、主に全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を用いた動的アクチンフィラメントのリアルタイム観察は、重要な技術として浮上し、バルク溶液生化学的アッセイ1では得られなかった結果の印象的なリストを提供してきました。

これを達成するには、蛍光標識されたアクチンフィラメントを顕微鏡カバースリップの表面近くに維持し、蛍光標識も可能なアクチン結合タンパク質(ABP)の溶液にさらす必要があります。そうすることで、適切に制御された生化学的条件下で個々のフィラメントで起こっている事象を監視し、反応速度を定量化する手段が提供されます。ただし、いくつかの特定の制限を考慮する必要があります。フィラメントを表面近くに人為的に維持することは、しばしば複数のアンカーポイントのおかげで、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤を使用することによって、それらの挙動を変えることができる(例えば、それらの重合および解重合の一時停止を引き起こす2)。各フィラメントの輪郭を追跡することは、特に新しいフィラメントまたはフィラメントの断片が時間の経過とともに視野に蓄積する場合、困難な場合があります。反応は有限の体積で起こり、アクチンモノマーおよびABPの濃度は時間の経過とともに変化する可能性があり、正確な速度定数を導出することが困難になる可能性があります。最後に、ABPの溶液を更新または変更することは、30秒未満で達成することは困難であり、しばしばサンプル中の不均一なタンパク質含有量につながる。

10年以上前、個々のデオキシリボ核酸(DNA)鎖3を研究するためにすでに行われたことに触発されて、個々のアクチンフィラメント4を観察および操作するためのマイクロフルイディクスに基づく新しい技術を導入しました。これにより、古典的なシングルフィラメント技術の前述の制限を回避することができます。これらのマイクロフルイディクスアッセイでは、アクチンフィラメントは、カバースリップに吸着されたスペクトリンアクチン種子から成長させる。したがって、フィラメントは、マイクロ流体チャンバの底部にのみ一端によって固定され、固着することなく表面上で変動する。フィラメントは入ってくる溶液の流れと整合するため、輪郭の長さの監視が容易になり、TIRFを使用できるカバースリップの上の浅い領域に維持されます。異なる溶液は混合することなく同時にチャンバに流され、フィラメントは逐次的かつ迅速にそれらに曝され得る。

ここでは、ラボでシングルアクチンフィラメントマイクロフルイディクスアッセイを設定するための一連の基本的なプロトコルを提案します。カバースリップとマイクロフルイディクスチャンバーは事前に(半日で)準備することができ、いくつかの生化学的条件をテストできる実験自体は1日未満で行われます。

Protocol

1. マイクロ流体チャンバー調製 複数のチャンバーパターンを持つSU-8マスターモールドを選択します。典型的なチャンバは、高さ20μm、幅800μmの3つの入口と1つの出口を備えた十字型です(図1)。このようなマスターモールドは、外部企業から購入することも、学術研究所で製造することもできます(例えば、Gicquel、Y. et al.5)。 ?…

Representative Results

上記のすべての実験において、蛍光標識されたアクチンフィラメントは、表面からのバックグラウンド蛍光が低いことを示す良好なコントラストで、はっきりと見えるはずです(図4、一般的な問題のトラブルシューティングについては、 補足ファイル1 を参照してください)。アクチンフィラメントはまた、表面にくっついてはならない:支配的な流速が低い?…

Discussion

アクチンフィラメントが長さに沿って複数の点によって表面に固定されるか、またはメチルセルロースなどのクラウディング剤によって表面の近くに維持される標準的なシングルフィラメント法と比較して、マイクロフルイディクスは多くの利点を提供する。表面との相互作用は最小限であるため、これらの相互作用が伸長および解重合の両方の間に誘発し得る人工的な一時停止は回避され?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

B.ラドゥーとR.-M.に感謝しています。彼らのUVクリーナー装置の使用のためのMègeラボ、およびJ. Heuvinghと0。デュ・ルーレは、シリコンウェーハ上の金型の準備とマイクロ流体学のヒントの提供について受けた初期トレーニングを受けました。我々は、欧州研究評議会グラントStG-679116(A.J.へ)及びAgence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin(G.R.-L.)からの資金提供を認める。

Materials

β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder
Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5
Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001
Pressure controller
Model 42 – UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

参考文献

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

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記事を引用
Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

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