我々の臨床研究で発見された家族性遺伝性心筋症ファミリーに基づいて、CRISPR/Cas9を介したゲノム工学により、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作成し、この変異を検証しました。
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方法論記事
マウスモデルを用いた家族性肥大型心筋症におけるMYH7変異Gly823Gluの病態解明
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
家族性肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は、中国で最も一般的な心筋症です。しかし、HCMの根底にある遺伝的病因はとらえどころのないままです。
我々は以前、HCMを有する中国の大規模な漢族において、ミオシン重鎖7(MYH7)遺伝子ヘテロ接合型変異体NM_000257.4:c.G2468A(p.G823E)を同定した。このファミリーでは、バリアントG823Eは常染色体優性障害と共離します。この変異体は、MYH7タンパク質の頸部領域のレバーアームドメインに位置し、相同ミオシンおよび種の間で高度に保存されています。G823E変異体の病原性を検証するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作製しました。gRNAターゲティングベクターとドナーオリゴヌクレオチド(ターゲティング配列に134 bpの相同性)を設計しました。ドナーオリゴヌクレオチド中のp.G823E(GGGからGAG)部位を、相同性指向修復によってMYH7のエクソン23に導入した。サイレンシングされたp.R819(AGGからCGAへ)も挿入され、相同性指向修復後の配列のgRNA結合および再切断を防止した。心エコー検査で生後2カ月齢のMYH7 G823E/-マウスに収縮期を伴う左室後壁(LVPW)肥大を認めた.これらの結果は、同様に組織学的分析によって検証されました(図3)。
これらの結果は、G823E変異体がHCMの病因において重要な役割を果たすことを示しています。今回の知見は、家族性HCMに関連するMYH7変異体のスペクトルを豊かにし、この中国人科における遺伝カウンセリングと出生前診断の指針となる可能性がある。
概要
肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は中国で最も一般的な心筋症であり、推定発生率は0.2%で、15万人が罹患しています1,2。
HCMを特徴付ける病理学的解剖学的特徴は非対称心室肥大であり、これはしばしば心室流出路および/または心室中隔を含む3。臨床症状は、労作性呼吸困難、疲労、および胸痛です。HCMの個々の表現型は、臨床的に潜行性から重度の心不全までの範囲の変動性を有する。HCMの患者は、治療、心臓移植、生命維持装置、および学際的なフォローアップを必要とします4。
前世紀、PCR技術はDNA5の研究方法を変えました。臨床診断のためのDNAシーケンシング法がSangerらによって発見された6。サンガー法はその後、ヒトゲノムプロジェクトに適用されましたが、このアプローチはコストと時間がかかりました7。全ゲノムシーケンス(WGS)の出現により、ヒトの遺伝病に関する洞察が新たな高みに達しましたが、コストの点で法外なままでした。全エクソームシーケンシング(WES)技術....
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プロトコル
家族の歴史は、家族にインタビューすることによって得られました。この研究は、広東省中医薬病院の倫理委員会(第2019074号)によって承認されました。家族全員から書面による同意を得た。すべての動物は、広東省中医薬病院(中国、広州)の倫理ガイドラインに従って治療されます。
1. 学習テーマ
注:発端者III-3は、2019年7月に広東省中医薬病院の心臓血管外科で医師の診察を受けました。
- 発端者の詳細な家族病歴を取得します。発端者の家族全員に通知して電話をかけます。家族全員が綿密な身体検査を受けています。
- 医療記録、ECG、心エコー図、心臓カテーテル検査レポートなど、すべての臨床データの系統的レビューを実行します。
- 介入または手術中にすべての患者の心臓表現型を再確認します。
- ローカルデータベースから合計174の人口ベースの健康対照を選択します。各患者から約4.0mLの末梢静脈血を採取します。.
2.DNA抽出
注:DNAは、製造元の指示に従って市販の血液キットで抽出されます。
- メーカーのプロトコルに従って、DNA安定剤の....
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結果
家族の臨床プロファイル
HCMの家系血歴が得られ、 図2に示されている。文書化された家族全員が登録時にHCMと診断されました。
家族(図2A)では、発端者は患者III-7であり、46歳でHCMと左心室流出路閉塞(LVOTO)と診断され、心臓手術を受けました。患者III-3は、外科的治療を必要としない軽度のHCMを有していた。患者IV-3も軽度のHCMを有しており、これは彼の父親である患者III-3と同様であった。患者II-5はHCMを患っており、LVOTOによる51歳で欠陥を修復する手術を受けました。患者I-1と患者II-2はそれぞれ57歳と46歳で心臓事故のために死亡しました。患者I-1の病歴は利用できませんでした。患者II-7および患者III-9は息切れを呈し、HCMと診断された。
エクソーム配列解析と変異体の分離
このファミリーでは、5人のエクソームシーケンシングにより、合計19,978,7.......
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ディスカッション
本研究では,HCMを有する中国漢族の家族について述べる。遺伝学解析により、ヘテロ接合型のMYH6変異p.G823Eは、常染色体優性遺伝の家族において疾患と共分離することが明らかになりました。G823E変異の病原性を検証し、そのメカニズムを議論するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMyh7遺伝子座にG823Eを備えたC57BL/6Nマウスモデルを作成しました。
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスの表現型特性を心エコー検査により評価した。C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスでは、対照と比較して、多重線維柱帯と非圧縮心筋層の比率が高いことが見られました。トランスジェニックマウスはまた、LVPWおよびIVS肥大およびHRの増加を示した。しかし、心臓の機能は2つのグループ間で有意な変化を示さなかった。これらの結果から,HRの増加は心臓リモデリング時の脳室機能の維持に代償効果を示す可能性が示唆された。心臓の形態と機能を観察および分析するには、さらなる研究.......
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開示事項
著者は、宣言する金銭的利益相反はありません。
謝辞
この研究は、広東省の医学研究基金プロジェクト(A2022363)および中国広東省科学技術委員会の主要プロジェクト(助成金番号2022)によってサポートされました。
この原稿の準備に協力してくれたメリーランド大学カレッジパーク校のQingjian Chenに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5倍;TBE | 上海三言2 | ||
| 回;Taq Master Mix(ダイプラス) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| アガロース | ・レグ | ||
| 小動物用麻酔器 | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro 消化法によるgRNA検出目標効率キット | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNAマーカー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| DNA安定剤 | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNA安定LD | DNAの分解を防ぐ |
| 電気パラフィンミクロトーム | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene 血液キット | サンタ クララ | ||
| ガラス スライド、カバースリップ | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| ヘマトキシリン染色液、エオシン染色液 | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml、C0109 | |
| HiSeq X-tenプラットフォーム | Illumina | 、捕捉されたライブラリのシーケンシングを実行します | |
| 絨毛性ゴナドトロピン | Livzon Pharmaceutical Group Inc.の注射。 | ||
| 妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピンの注射 | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| イソフルラン | 現地サプライヤー | 吸入 麻酔 | |
| マイクロインジェクション 顕微鏡 | ニコン | ECLIPSE TS2 | |
| NanoDrop | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 2000 | |
| パラフィン埋入機 | 瀋陽恒松技術有限公司 | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| シーケンサー | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| 実体顕微鏡 | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | エクソームプローブ | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| 温度ボックス | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma 塩酸塩溶液 | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| 獣医用超音波システム | Royal Philips | CX50 |
参考文献
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al.
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