概要

横方向ソフトライト照明 による 大脳オルガノイド培養の促進

Published: June 06, 2022
doi:

概要

脳オルガノイドは、臓器の発達とヒトの疾患病理を研究するための前例のない機会を提供します。脳オルガノイド培養系では大きな成功を収めていますが、この技術を適用するには運用上の困難が依然としてあります。本プロトコールは、培地交換およびオルガノイド移動を容易にする大脳オルガノイド手順を記述する。

Abstract

現在、大脳オルガノイド培養技術は依然として操作が複雑であり、大規模に適用することは困難である。シンプルで実用的な解決策を見つける必要があります。したがって、より実現可能な脳オルガノイドプロトコルが本研究において提案されている。培地交換やオルガノイド移動における避けられない不便さを早期に解決するため、現在の研究では工学原理を応用して運用技術を最適化しています。軟質ライトランプを採用して胚様体(EB)サンプルを横方向に照らし、拡散反射効果を高めてEBを肉眼で見ることができました。回転によって生成される二次流れの原理を使用して、オルガノイドは井戸の中心に向かって集まり、培地交換またはオルガノイド移動の動作を容易にする。分散した細胞と比較して、胚様体はピペット内でより速く沈降する。この現象を使用すると、ほとんどの遊離細胞および死細胞断片を簡単な方法で効果的に除去することができ、EBが遠心分離による損傷を被るのを防ぐことができる。この研究は、脳オルガノイド培養の操作を容易にし、脳オルガノイドの適用を促進するのに役立つ。

Introduction

2次元(2D)培養系と比較して、3次元(3D)培養系は、特定の器官の真の複製および複雑な構造の効率的な再生を含むいくつかの利点を有する1。したがって、脳オルガノイドは、ヒトの脳の発達や疾患2、薬物スクリーニング、細胞治療などの研究分野にとって重要な補助方法の一つである。

回転懸濁法によって大脳オルガノイドを培養することは、それらの発達および成熟に資する3.脳オルガノイド培養系は大きな成功を収めていますが、依然としてその適用を制限する重大な課題に直面しています。例えば、手作業による栽培は複雑な操作工程を伴い、大規模な施用を実現する上での障害となります。さらに、脳オルガノイドの培養における各発達段階では、異なる培地およびサイトカインの変化が必要である4。しかし、初期段階では、オルガノイドまたはEBは小さなサイズ(約200μm〜300μm)を有し、適切な装置なしではほとんど視覚的にアクセスできない。必然的に、培地を交換すると、一定量の貴重なオルガノイドサンプルが洗い流されます。他の種類のオルガノイド培養においてこれを克服するために多くの技術が探求されており、いくつかの例には、オルガノイドチップ全体を介入なしに3日間培養培地に浸漬することが含まれる5;古い媒体が吸収紙5を用いて吸収された後、カバースリップを通して新鮮な媒体を添加するステップと、または流体交換のために複雑なマイクロ流体パイプラインを適用する6,7,8オルガノイド培養の初期段階で遭遇するもう一つの障害は、肉眼で直接観察を達成することの難しさであり、オルガノイド移送ステップ中にオルガノイドの損傷および損失につながる貧弱な操作を引き起こす可能性がある。したがって、オルガノイドを生成するための培地交換およびオルガノイド移動を容易にする、より実現可能なプロトコルを確立する必要がある。

これらの問題を克服するために、工学原理に基づく対応する最適化された操作が提案され、これは多くのオルガノイド手順を有意かつ便利に容易にする。自然界では、太陽が窓の隙間から家に照らされると、肉眼では光線の中で踊るほこりを見ることができます。ほこりに太陽光が拡散反射するため、一部の光が眼球に屈折して視覚的な画像が生成されます。この現象9,10の原理に触発されて、この研究は柔らかいライトランプを作り、EBを横方向に照らしました。EB は、表示範囲に影響を与えずに視覚的に明瞭であることがわかりました。渦電流11により培養プレートを回転させることにより、中心を指す二次流れが液体中に発生する。もともと分散したEBはプレートの中央に蓄積します。これに基づき、オルガノイドの沈降速度が細胞の沈降速度よりも速いという現象や、遠心分離を行わずに培地交換やオルガノイド移送の容易な操作方法が提案されている。培養液中のオルガノイドは、この移入操作によって遊離細胞および死細胞断片から効果的に分離することができる。

ここでは、ヒト多能性幹細胞から脳オルガノイドを生成するために、操作が容易なプロトコルが提案されている。操作技術は、エンジニアリング原理を適用することで最適化され、3D文化での操作を2D文化の操作と同じくらいシンプルで実現可能にしました。改善された液体交換法およびオルガノイド移送操作は、他のタイプのオルガノイド培養および自動培養機の設計にも有用である。

Protocol

議定書はヘルシンキ宣言に従って実施された。広州医科大学第三附属病院の倫理委員会より承認を得ました(医学倫理審査[2021]第022号)。実験の前に、各培地をユルゲン・A・ノブリッヒの式12 (補足表1〜4)に従って調製し、または市販の脳オルガノイドキットを使用した( 材料表参照)。本研究で用いたiPS細胞は、当研究室が事前に確立したものであり?…

Representative Results

本研究は、iPS細胞(図2B)を脳オルガノイド(図2C)に誘導した。初期段階で栽培されたEBsはOCT4マーカー(図2A)を発現し、良好な多能性を示した。後の段階では、EBは成熟した脳オルガノイドに発達した(図2D)。この研究では、正常な健常者およびSCA3患者からiPS細胞を脳オルガノイドに培養した(?…

Discussion

脳オルガノイドは、医学研究のための新しい道を開きます。この技術の多くの有用な応用は、まだ探求され始めたばかりである28。この研究は、遺伝的に罹患した大脳オルガノイドと正常な脳オルガノイドのトランスクリプトームシーケンシング結果が、疾患と健康の違いを反映し得ることを見出した。例えば、RNA-seqデータ解析結果(図3B)は、SCA3疾患?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、広東省自然科学財団(助成番号2020A0505100062)、広州市科学技術重点プロジェクト(助成第201904020025号)、中国国家自然科学財団(助成第31872800号、32070582、82101937)、広州市ポスドク研究助成事業(陳邦珠市宛)の支援を受けた。

Materials

0.2 μm Filter NEST Biotechnology, China 331001
1000 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405163
200 μL wide-bore pipette tip Thermo Fisher Scientific, USA 9405020
2-Mercaptoethanol Merck, Germany 8057400005
4% Paraformaldehyde Servicebio, China G1101
6-well low adhesion plate NEST Biotechnology, China 703011 It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution STEMCELL Technologies, Canada 07920 It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well STEMCELL Technologies, Canada 34811 Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies, Canada 07010 Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement Thermo Fisher Scientific, USA 12587010
bFGF Peprotech, USA GMP100-18B
BSA Beyotime Biotechnology, China ST025
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810 R It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass Shitai Laboratory Equipment, China 10212020C
DAPI Beyotime Biotechnology, China C1002 Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific, USA 11330032
ES-quality FBS Thermo Fisher Scientific, USA 10270106
Ficoll Paque General Electric Company, USA 17-5442-02 Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin Sangon Bioteach, China A609764
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 35050061
Glutamax supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody Abcam, UK ab150171 Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody Abcam, UK ab150120 Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody Abcam, UK ab150077 Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin Merck, Germany H3149
Horizontal shaker Servicebio, China DS-H200 Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin Merck, Germany I9278-5ML
KOSR Thermo Fisher Scientific, USA 10828028
Matrigel Corning, USA 354277 Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA Thermo Fisher Scientific, USA 11140050
mTeSR1 STEMCELL Technologies, Canada 85850 iPSC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher Scientific, USA 17502048
Neurobasal Thermo Fisher Scientific, USA 21103049
OCT4 primary antibody Abcam, UK ab19857 Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer Leica, Germany Leica CM1860
PAX6 primary antibody Abcam, UK ab78545 Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS STEMCELL Technologies, Canada 37350
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific, USA 15140122
PSC dissociation solution Beijing Saibei Biotechnology, China CA3001500 Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific, USA A16518 Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass Shitai Laboratory Equipment, China 188105W
Soft light lamp NUT NUT A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit STEMCELL Technologies, Canada 8570 Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit STEMCELL Technologies, Canada 8571 Maturation Medium
Sucrose Sangon Bioteach, China A502792
Triton X-100 Merck, Germany X100
TUJ1 primary antibody Abcam, UK ab41489 Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline Sangon Bioteach, China A510146
Y-27632 STEMCELL Technologies, Canada 72302 Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences GSA-Human: HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

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記事を引用
Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen, D., Zhang, Y., Sun, X. Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination. J. Vis. Exp. (184), e63989, doi:10.3791/63989 (2022).

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