このプロトコルは、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を測定するための手順を説明しています。
膀胱膨満に応答して尿路上皮から放出されるATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられている。したがって、生理学的設定での尿路上皮ATP放出の正確な測定は、膀胱内のプリン作動性シグナル伝達を制御するメカニズムを研究する上で重要な最初のステップです。機械的に誘発される尿路上皮ATP放出を研究するための既存の技術は、柔軟な支持体またはUssingチャンバーに固定された膀胱組織に播種された培養細胞を利用します。ただし、これらの各手法は、無傷の膀胱の状態を完全にはエミュレートしません。したがって、げっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を直接測定するための実験装置が開発された。
この設定では、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱は、膀胱の ドームと外 尿道開口部の両方のカテーテルを介して灌流されます。膀胱内の圧力は、尿道カテーテルをキャップしながら、ドームを介して滅菌液を膀胱に灌流することによって増加します。膀胱内圧の測定は、膀胱測定に使用されるセットアップと同様に、膀胱ドームカテーテルに取り付けられた圧力トランスデューサを使用して行われます。所望の圧力に達すると、尿道カテーテルのキャップが取り外され、ルシフェリン-ルシフェラーゼアッセイによるATP定量のために液体が収集されます。この実験セットアップを通じて、尿路上皮ATP放出の機械的および化学的刺激の両方を制御するメカニズムは、灌流液にさまざまなアゴニストまたはアンタゴニストを含めることによって、または野生型動物と遺伝子組み換え動物の結果を比較することによって調べることができます。
尿中ATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられています1。例えば、ATPは膨満に応答して尿路上皮から放出され、膀胱求心性神経の受容体に作用して興奮性を高め、満腹感をもたらすと考えられています2。したがって、尿中ATPは膀胱病変の発症において重要なプレーヤーである可能性があるとも考えられています。この仮説を支持するために、尿中ATP濃度は、過活動膀胱(OAB)3、膀胱痛症候群/間質性膀胱炎(BPS / IC)4、または尿路感染症(UTI)5,6に苦しむ患者で有意に増加します。逆に、膀胱を空にすることができないことを特徴とし、時には膀胱の満腹感を感知する能力の低下を含むことがある低活動膀胱(UAB)に苦しむ患者は、尿中ATP濃度が低下していることが示されています7。実験的には、尿中ATP濃度の操作はラットの膀胱反射を変化させる可能性があります。膀胱内腔の内因性ATPアーゼを遮断することによってATP濃度を増加させると排尿頻度を増加させることができ、一方、外因性ATPアーゼを膀胱に注入することによってATP濃度を低下させると排尿頻度が低下する8。したがって、膀胱機能に対する尿中ATPの重要性は明らかである。
膀胱病理に対する尿中ATPの明らかな重要性を考えると、尿路上皮ATP放出の正確な測定は、放出を制御するメカニズムを理解する上で重要なステップです。尿路上皮ATP放出を測定するために、異なる実験モデルを用いて多くの研究が完了している。これらの中で最も重要なのは、初代培養または細胞株のいずれかの細胞培養です。しかし、培養尿路上皮細胞の使用は、特殊な透過性膜(Transwell技術[ウェルインサート]など)で増殖させない限り、尿路上皮細胞が生理学的分極形態をとらないという事実によって複雑になります9。したがって、測定された任意のATP放出を生理学に関連付けることは困難である。ウェルインサート上で増殖した尿路上皮細胞は分極し、 in vivoで見られるものと同様の障壁を形成する可能性があります。ただし、完全に分化した尿路上皮の成長には数日から数週間かかる場合があります。さらに、ウッシングチャンバーにウェルインサートを取り付け、頂端側に圧力を加えて伸張させることは可能ですが、病理学中に膀胱内の状態を模倣するのに十分な圧力(すなわち、30 cm H2O以上の圧力)を適用することは困難です。膀胱組織全体をストレッチ実験のためにUssingチャンバーに取り付けることもできますが、これにより、尿路上皮細胞の健康、したがって尿路上皮バリア機能を維持する栄養因子とともに、膀胱が生物から除去されます。したがって、伸張または圧力に応答した尿路上皮からのATPの放出を研究するための最も生理学的に関連性のある方法は in vivoである。実験のセットアップに必要な外科的技術は、動物の膀胱測定で一般的に使用されるものと同じであるため、その技術に精通している人なら誰でも簡単に実行できるはずです。
このプロトコルでは、以下で説明する経尿道的カテーテル法は女性の方がはるかに簡単であるため、体重約200〜250 gの雌Sprague Dawleyラットの管腔ATPを調べるために使用される技術について説明します。しかしながら、経尿道的カテーテル法は、雄のげっ歯類10においても行うことができる。経尿道的カテーテル法は現在、男女両方のマウスでも行われているため11、これらの実験は、研究チームのニーズに応じて、性別またはさまざまなサイズのマウスまたはラットに簡単に適応させることができます。
尿路上皮ATP放出に関する研究の大部分は、不死化細胞株またはげっ歯類の尿路上皮細胞の初代培養のいずれかを使用して、培養細胞で行われます。これらのモデルには、スループットが比較的高いという利点がありますが(つまり、1回の培養/継代で細胞のプレート/皿を多数作成できます)、生理学的関連性は、1)尿路上皮細胞が特別な支持体上で増殖しない限り分極的に増殖できないこと、お…
The authors have nothing to disclose.
本研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)からJMBへの助成(DK117884)の支援を受けて行われました。
amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |