細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構

生細胞は独特の機械的性質を持っています。加えられた力に受動的に反応する能力に加えて、それらはまた、外部刺激に応答して能動的に力を生成することができる¹。これらの特性は、特に細胞運動中のさまざまな細胞プロセスに不可欠であり、主に細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシン分子モーター、およびアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。これらのアクトミオシンネットワークは、アクチンフィラメントを架橋し、ATP加水分解によって燃料となるネットワークに機械的ストレスを積極的に生成するミオシンモータータンパク質によって駆動される固有の自己組織化および収縮特性を示します²。

細胞骨格の材料特性を研究するために、数多くの実験的および理論的研究が行われてきた³。一般に受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料⁴として振る舞うというものである。これは、短い時間スケールでは細胞骨格が弾性材料として振る舞い、長い時間スケールでは、架橋タンパク質とミオシンモーターの剥離(および再付着)により粘性流体として振る舞い、ネットワークが動的に回転することを可能にすることを意味します。しかし、多くの場合、粘弾性モデルは実験結果を記述できず、細胞骨格、より一般的には細胞質が多孔弾性活物質として記述されている図とより一致しています^5,6。2つの主な特徴がこれらのタイプの材料を特徴付ける。(i)第¹の主な特徴は、細胞ブレブ7、運動性⁸、細胞形状振動⁹などのプロセスの根底にあるミオシンモーターによって駆動される収縮性勾配によって、ゲル細孔を横切る浸透性細胞ゾル(「溶媒」)の流れの生成です。そのような細胞質流の出現は、ブレブのために局所的であり得るか、または細胞運動性のように局所的であり得る。後者の場合、細胞後部で加えられた収縮応力は、細胞前面に向かって細胞質液の流れを駆動し、それはラメリポディアアセンブリ⁸に必要なタンパク質プールを補充する。(ii)第²の主な特徴は、応力の緩和が拡散性であり、ゲル弾性率、ゲル多孔度、および溶媒粘度に依存する実効拡散定数によって特徴付けられることです5。多孔弾性拡散定数は、加えられた応力に対するシステムの応答速度を決定します。拡散定数が高いほど、応力の再分布が速くなります。これにより、ミオシンモーターによって生成される活発な収縮ストレスなど、外部または内部に適用された機械的ストレスの後に、細胞内細胞質液が細胞内に再分配されるのにかかる時間が決まります。したがって、これらの例は、細胞骨格と細胞質ゾルの機構が緊密に結合しており、別々に扱うことができないことを示しています³。

細胞はさまざまな方法で機械的特性を調節できるため、ネットワーク力学と流体力学の相互作用はよくわかっていません。強力な代替アプローチは、さまざまな微視的成分とシステムパラメータの完全な制御を可能にするin vitro再構成システムを使用することであり、これにより、これらのモデルシステムは物理分析に最適です^10,11。このアプローチは、アクチンベースの運動性に対するタンパク質組成とシステム形状の影響を研究するために首尾よく採用されています12、13、14、15、16、^17、18、アクトミオシンネットワークの2Dパターニング¹⁹、²⁰、^21、22、およびこの論文の焦点である多孔弾性アクトミオシンゲルのネットワーク収縮性と流体力学の間の相互作用²³。

この原稿では、制御可能な寸法と材料特性の収縮弾性アクトミオシンネットワークの調製について、Ideses et ^al.23の研究に基づいて議論されています。収縮ゲルと排出溶媒のダイナミクスが分析および定量化され、これらのアクトミオシンゲルが多孔弾性活物質として記述できることが実証されます。応力拡散性に対する溶媒粘度の影響を研究することで、これらのネットワークの多孔弾性特性がさらに確認されます。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が提供されます。最後に、実験上の課題、一般的な落とし穴、および実験結果と細胞骨格との関連性についても説明します。

1.ガラス表面処理と不動態化:

注:このセクションには、(i)洗浄と親水化、(ii)シラン化、および(iii)表面不動態化の3つの主要なステップが含まれています( 図1を参照)。

1. 洗浄と親水化
   1. ガラス表面の洗浄にはピラニア溶液を使用してください。
      注:ピラニア溶液は、30%H 2 O 2と70%H₂SO₄の混合物です(材料表)。その主な目標は、カバーガラス表面から有機汚染を除去し、ガラス表面のOH基を露出させることです。このようにして、ガラス表面は親水性となる。
   2. 10-12 #1.5(22 mm x 22 mm)ガラスカバーガラスカバースリップ(材料表)を自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダー(ベース面積:5.5 cm x 5.5 cm)に入れます。ポリテトラフルオロエチレンホルダーを400 mLビーカー(材料表)に移し、300 mLのピラニア溶液で2時間インキュベートします。氷の上と化学フードでこのステップを行います。
      注意: ホルダーベースにねじ込まれたポリテトラフルオロエチレンポールの長さは12 cmで、ビーカー(11 cm)よりも長く、ピラニア溶液へのホルダーの安全な移動/引き出しを可能にします。ピラニア溶液は依然として反応性が高く、非常に高温である可能性があるため、反応を停止することが不可欠です。反応を止める最も簡単な方法は、ピラニア溶液を(水道)水に注ぎ、(少なくとも)50倍に希釈することです。その後、溶液を安全に廃棄できます。使用済みのピラニア溶液を閉じたガラス瓶に入れないでください–これはボトルの爆発で終わる可能性があります。
   3. ポリテトラフルオロエチレンホルダーを新鮮な二重蒸留水(DDW)で満たされた清潔なビーカーに移して、カバーガラスから余分なピラニアを洗い流します。
   4. ビーカーを超音波処理浴(材料表)に移し、25°Cで10分間フルパワーで80Hzで超音波処理する。 新しいDDWでこの手順をさらに2回繰り返します。毎回新鮮な重水素水を使用してください。
2. シラン化
   1. ホルダーを300mLの純粋なメタノール(材料の表)で満たされたきれいなビーカー(400mL)に移し、次いで超音波処理浴(材料の表)に移す。25°Cで30分間フルパワーで80Hzで超音波処理する。
   2. 超音波処理後、15mLの重水素減少水、3.1mLの酢酸(材料表)、340mLのメタノール、および7.6mLのシラン(((3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン)を使用して調製したシラン溶液にホルダーを移す(材料表)。ビーカーをパラフィルムで密封し、4°Cの冷蔵庫で一晩保管します。
      注意: シラン溶液の調製と取り扱いは、化学薬品フード内で行う必要があります。シラン化工程後、使用済みのシラン溶液(廃液)を薬液フード内の専用ガラス瓶に入れます。
   3. 翌日、ホルダーを300 mLの純粋なメタノールで満たされた清潔なビーカーに15秒間移します。次いで、ホルダーを清潔なビーカーに移し、ポリテトラフルオロエチレンホルダーの底部を乾燥させる前ではなく、過剰のメタノールを除去した。ビーカーをオーブンに移し(材料表)、ガラスカバーガラスを120°Cで5分間乾燥させます。
3. 不活性ポリマーによる表面パッシベーション
   1. ガラスカバーガラスを不活性ポリマーでインキュベートすることにより、表面パッシベーションを実現します(材料表)。実験ごとに、2枚のカバーガラスを取り、最初にエタノール(EtOH)で洗浄したパラフィルム層でコーティングされたペトリ皿に入れます(重水素水腫/EtOH:30/70 vol / vol)(材料表)。
   2. 各カバーガラスを1 mLの4 mg·mL⁻¹ 5 kDa分子量メトキシポリエチレングリコールマレイミド(mPEG-mal、M_w = 5 kDa)(材料表)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(材料表)中で22°Cで1時間インキュベートします。
      注意: カバーガラスを疎水性パラフィルム層に置くと、親水性PEGポリマー溶液がガラスカバーガラス表面に閉じ込められます。インキュベーション時間は、最適なパッシベーションを達成するために重要です。45分から2時間の範囲のインキュベーション時間を使用してください。このインキュベーション時間を超えると、ガラスカバースリップの表面が劣化し、タンパク質の接着や透明性の低下につながる可能性があります。
   3. インキュベーションプロセスの最後に、各カバーガラスを5 mLの重水素減少水ですすぎ、N₂ (ガス)の流れで乾燥させます。カバーガラスを真空下で乾燥させないでください。パッシベーション後はカバーガラスを濡らしておく必要があるため、すぐに1 mLの10 mM Trisをペグ化表面に置きます。カバーガラスは2時間以内に使用してください。
      注意: ガラス表面の汚染を防ぐために、さまざまな手順を層流チャンバーで実行する必要があります。

2. タンパク質精製

1. ゲルろ過法²⁴を使用してウサギ骨格筋アセトン粉末からG-アクチンを精製する。
   1. アクチン精製には1週間かかります。精製した G-アクチンを G-バッファー (5 mM Tris pH 7.8, 0.01% NaN₃, 0.1 mM CaCl 2,_0.2 mM ATP, 1 mM DTT) に保存し、氷上で保存します。2週間以内にソリューションを使用してください。
      注意: 数日ごとに氷を交換してください。
   2. アクチンをマレイミド修飾蛍光色素¹⁶ で標識する(材料表)。GST-ファシンを小野らの方法に基づいて精製する²⁵。両方のタンパク質を液体N₂中で瞬間凍結し、−80°Cで保存する。
2. 標準プロトコールを使用して、ウサギ骨格筋からミオシンIIを精製する²⁶。精製されたミオシンII(ダイマー)ストックバッファーには、10 mM Tris pH 7.4、0.5 M KCl、および35% w/vスクロースが含まれています。ミオシンを液体_N2中で急速凍結し、−80°Cで保存する。
   注:高濃度のKClはミオシンモーターを二量体形態に保ち、スクロースの割合が高いため、凍結時にモーターの活動が妨げられないことを保証します。ミオシンIIストック溶液を扱う場合は、粘性流体の取り扱いに専用のピペットを使用してください(材料表)。
   1. ミオシンII二量体を蛍光色素で標識し(材料表)、操作されたシステイン残基のペアで^19,27。そのためにニワトリ砂嚢RLC変異体Aを使用する²⁶.標識したミオシンIIを液体_N2中で急速凍結し、−80°Cで保存する。
      注:この標識手順は、標識されたミオシンが天然のミオシンIIタンパク質として活性であることを保証します。
3. UV-Vis分光光度計(材料表)を使用してストックタンパク質溶液の吸光度を測定し、次の吸光係数を使用してBeer-Lambertの法則でタンパク質濃度を推定します:G-アクチン(ε₂₉₀ = 26,460 M-1・^cm-1)、GST^-ファシン(ε 280 = 99,330 M−1・cm−1)、ミオシンII二量体(ε_{280 = 268,800} M−1・cm⁻¹)、 RLC変異体A(ε₂₈₀ = 3,960 M−1・cm⁻¹)¹⁹。

3. サンプル調製

注:ミオシンIIモーターと強力な受動架橋剤ファシンの大きな凝集体の存在下でアクチンモノマーを重合して、巨視的に収縮する弾性アクトミオシンネットワーク^{を生成します19,23}。蛍光ビーズを溶液に添加することで、ゲル収縮中の溶媒の流れを追跡できます。

1. タンパク質(「アクトミオシン」)溶液
   1. G-アクチンを除き、少量のアリコートで-80°Cに保ち、37°Cで解凍してから使用してください。アクトミオシン溶液の総容量は40μLです。
   2. 10 mM Tris pH 7.4、2 mM MgCl₂、25 mM KCl、1 mM ATP、ATP再生系(0.5 mg·mL-1クレアチンキナーゼおよび5 mMクレアチンリン酸)、200 μM EGTA (キレート^Ca2+イオン)、漂白防止溶液(0.1 mg·^mL-1グルコースオキシダーゼ、0.018 mg·mL-1カタラーゼ、および5 mg·^mL-1グルコース)を混合して溶液を調製します。 5 μM G-アクチン、280 nM GSTファスチン、および1.67 nM ミオシンII。標識G-アクチンの割合は5%(モル百分率)である。
      注:ゲル収縮の進行段階での蛍光シグナルの飽和を避けるために、標識されたG-アクチンの割合を低くしてください。
2. ミオシンIIモーター凝集体の調製
   1. ミオシンモーターを凝集体の形でタンパク質溶液に加える。大きなミオシン凝集体(150ミオシン二量体/凝集体)を形成するには、ミオシンストック溶液を10 mM Tris pH 7.4で希釈して、最終濃度25 mM KClにします。
   2. 希釈したミオシン溶液を室温(RT)で10分間保持し、使用するまで氷に移します。モーターは最大2時間完全にアクティブです。
3. 溶媒流量の測定
   1. ゲル細孔を横切る溶媒の流れを追跡するには、蛍光ビーズをアクトミオシン溶液に加えます。ビーズを不動態化することにより、ビーズとアクトミオシンネットワークとの間の相互作用を減少させる。実際には、1 μLのビーズ(材料表)を5 μM G-アクチンとともにRTで20分間インキュベートした後、遠心分離(材料表)によって余分なG-アクチンを除去します(条件:6,000 x g 、4°Cで5分間)。
   2. 10 mg·mL⁻¹ ウシ血清アルブミン(BSA)(材料表)でこの手順を繰り返し、残りのコーティングされていない表面を(おそらく)ブロックします。実験では、1:10,000 vol/volの最終希釈でビーズを使用します。
      注:ビーズ/ポアサイズ比がすべての段階で<1になるように、ビーズの直径をゲルの細孔サイズに適合させることが重要です。
4. 溶液粘度の影響
   1. アクトミオシン溶液にグリセロール(材料表)を添加して溶液の粘度を制御します。0%〜34%の範囲の重量パーセントでグリセロールを添加すると、溶液粘度が η_ωから2.76 η_ωに上昇し、 ここでη_ωは20°Cでの水の粘度である²⁸。
      注意: グリセロールを扱う場合、粘性流体の取り扱いには専用のピペットを使用することが不可欠です(材料表)。

4. テストの実行

1. 自家製サンプルホルダーの取り扱い
   1. PEG不動態化カバースリップの1つを取り、その上にグリースを塗ったパラフィルムスペーサーを置き、サンプルホルダーに入れます。
      注意: パラフィルムスペーサーは任意のスペーサーと交換できます。
2. アクトミオシン溶液の調製
   1. さまざまな微視的成分を組み込み、ミオシンIIモーター凝集体を添加し、最後にEGTAを添加することにより、マイクロ遠心チューブ内の氷上でアクトミオシン溶液を調製します。溶液をよく混ぜる。EGTAの添加により、アクトミオシンネットワーク重合が開始され、実験の開始時間が設定されます。
3. その溶液1.1 μLをホルダーに取り付けられたカバーガラスに置き、2番目のカバーガラスを上に置きます。ホルダーをねじ込んでサンプルを密封します。このプロセスは、円盤状の形状を採用したドロップをわずかに絞ります。落下直径は2,800〜3,000μmの範囲です。
4. サンプルホルダーを顕微鏡に置き、取得を開始します。初期取得時間を短縮するために、事前に顕微鏡を準備してください。通常、混合後、サンプルイメージングを開始するのに1〜2分かかります。

5.顕微鏡技術

1. 専用ソフトウェア(材料表)で制御する倒立蛍光顕微鏡(材料表)を用いて試料を画像化します。
   1. 2.5倍/0.075倍の低倍率のPlan-NEOFLUAR対物レンズ(材料表)を使用して、ゲル領域全体を視覚化し、その巨視的な収縮を経時的に追跡します。
   2. 10x/0.3 Ph1 UPlanFL対物レンズ(材料表)を使用して、ネットワークの多孔性と構造を特徴付け、ネットワークの自己組織化と収縮を経時的に追跡します。
      注:この目的は、ネットワーク内のミオシンIIモーター凝集体を局在化し、ゲル細孔を横切る蛍光ビーズの動きを追跡するのにも役立ちます。より高い倍率を使用することができ、これは視野の減少を犠牲にして、デュアルカラーイメージングモードでさらに重要です(材料表)。
2. サンプルを488 nm(アクチン/蛍光ビーズ)および561 nm(ミオシンモーター凝集体/蛍光ビーズ)で励起します。電子増倍型電荷結合素子(EMCCD)カメラ(材料表)でストリーミングモードで専用ソフトウェア(材料表)で1フレームあたり100msの画像を取得します。
   注意: 蛍光灯(材料表)の強度は、ネットワークの収縮中の信号飽和を避けるために、可能な限り低い値に保つ必要があります。
3. 同時2色イメージング
   1. このモードは、(i)アクチンネットワーク内のミオシンモーター凝集体の局在を検出すること、および(i)ネットワーク収縮中の内外の外向きの溶媒の流れを特徴付けることの2つの目的で使用します。
   2. アクチンモーターとミオシンIIモーターをそれぞれ488 nmと561 nmで励起し、デュアルエミッション装置(材料表)を使用してEMCCDカメラ(材料表)に同時に画像を記録します。同じイメージングシステムを使用して、アクチンゲル(488 nm)と蛍光ビーズ(561 nm)を同時にイメージングします。

実験ごとに2枚のガラスカバースリップが使用されます。ガラスカバーガラスは、PEGポリマーで洗浄および不動態化されています。パッシベーションは、可溶化タンパク質が実験の初期段階でガラス表面に付着するのを防ぎ、収縮ネットワークとガラス壁との相互作用を最小限に抑えるために不可欠です。良好な不動態化を達成できないと、非効率的な収縮につながる可能性があり、極端な場合にはアクチンネットワーク形成を阻害することさえあります。

図1は、表面処理手順の3つの主要なステップを説明しています。これらのステップには以下が含まれます:(i)カバーガラス表面から有機汚染を除去し、ガラス表面のOH基を露出させるピラニア溶液を使用した表面洗浄と親水化。(ii)シランをガラス表面に共有結合させることを目的とした(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシランによる表面シラン化、各シラン分子がSH基で終わる。(iii)PEGポリマーによるパッシベーション(mPEG-mal、5 kDa)-このステップでは、PEGポリマーのマレイミド基が(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン上のSH基と共有結合して相互作用し、ガラス表面にPEG単層を形成します。

ピラニア処理とシラン化のために、10〜12枚のガラスカバースリップ#1.5(22 mm x 22 mm)をポリテトラフルオロエチレンホルダー(図2A)に入れ、そのホルダーを400 mLビーカーに移します。パッシベーションステップでは、2つのガラスカバースリップをパラフィルムでコーティングされたペトリ皿に転写します(図2B)。カバーガラスを疎水性パラフィルム層上に置くことで、親水性PEGポリマー溶液がインキュベーション時間を通してガラス表面に閉じ込められたままになります。各カバーグラスを1 mLの4 mg·mL−1 5 kDaのmPEG-malとともに1x PBS中で22°Cで1時間インキュベートします(図2B)。このPEGポリマーの分子量および濃度に対して、ガラス不動態化はPEG単層の形成をもたらし、各PEGポリマーはキノコ様立体配座29にある。インキュベーションプロセスの最後に、各カバーガラスを5mLの重水素減少水ですすぎ、N2 (ガス)の流れで乾燥させます。カバーガラスをすぐに使用しない場合は、カバーガラスの表面を濡らした状態に保つために、1 mLの10 mM Trisをペグ化表面に置く必要があります。カバーガラスは、実験を開始する直前にN2 (ガス)の流れで乾燥される。2時間以内にカバーガラスを使用することをお勧めします。

巨視的に収縮する弾性アクトミオシンネットワークは、5 μM のG-アクチンと16.7 nMのミオシンを混合し、大きな凝集体(~150個のミオシン二量体/凝集体)と280 nMの強力な架橋剤ファシンの形で添加することによって形成されます。この溶液には1 mM ATPが含まれており、ATP再生システムと漂白防止溶液を使用して一定に保たれます(プロトコルセクションの詳細を参照)。浸透溶媒の流れを分析するために、蛍光ビーズをアクトミオシン溶液に添加する。

実験は、標準的な顕微鏡ステージの寸法に適合する自家製のサンプルホルダーで実行されます(図3)。厚さh(~150μm)のグリースを塗ったパラフィルムスペーサーを2つのPEGパッシベーションカバースリップの1つに置き、そのカバースリップをサンプルホルダーに入れます(図3A)。次に、アクトミオシン溶液をマイクロ遠心チューブ内の氷上で調製し、さまざまな微視的成分を取り込み、最後にG-アクチン、ミオシン凝集体、次にEGTAを添加して、アクチン重合をトリガーします。溶液はよく混合する必要があります-これは実験の開始時間を設定します(t = 0)。すぐに、その溶液1.1 μLをカバーガラスの上に置き(図3B)、2番目のPEGパッシベーションカバースリップをその上に置き(図3C)、ホルダーをねじ込んで液滴を間に閉じ込めます(図3D)。この液滴体積とスペーサータイプの場合、液滴直径は約3,000μmですが、研究者はこれらの推定値に頼るべきではありません。実際の液滴の厚さと直径は、常に顕微鏡画像から直接測定する必要があります。厚さについては、共焦点顕微鏡を使用する必要があります。

サンプルホルダーを顕微鏡に置き、取得を開始します。顕微鏡は、取得を開始するまでの時間を最小限に抑えるために、事前に準備する必要があります。通常、サンプルイメージングを開始するには1〜2分かかります。サンプルは488 nmおよび/または561 nmで励起され、専用ソフトウェアによって制御される倒立蛍光顕微鏡を使用して画像化されます。画像は、EMCCDカメラを使用したストリーミングモードで、フレームあたり100ミリ秒(またはそれ以下)のレートで取得する必要があります。アクチンネットワークとミオシンモーター凝集体、または溶液中の蛍光ビーズを同時にイメージングするには、デュアルエミッションシステムを使用する必要があります。蛍光灯の強度は、ネットワーク収縮の進行段階での信号飽和を避けるために、できるだけ低く保つ必要があります。

2.5倍/0.075倍のPlan-NEOFLUAR対物レンズを使用して、ゲルの横方向の収縮ダイナミクスと、ゲルの長さスケールでの流体の流れの方向性と速度を特徴付けます。これらは、ゲル半径の経時変化を追跡するのに役立つ低解像度画像であり、そこからゲル半径方向(横方向)収縮速度を推定できます。ネットワークの構造と多孔性、ネットワーク内のミオシンモーター凝集体の位置、およびゲル細孔を横切る個々の蛍光ビーズの動きを解決するには、より高い倍率の対物レンズを使用する必要があります(例:10x/0.3 Ph1 UPlanFL対物レンズ)。より高い倍率も使用できますが、視野が狭くなり、デュアルカラーイメージングモードを採用するとより重要になります。(2D)蛍光顕微鏡データは、横方向と垂直方向の両方の収縮ダイナミクスを特徴付けるために、収縮ゲルの3D共焦点イメージングで補完する必要があります。共焦点顕微鏡は、2つのカバーガラス間の間隔を測定するために使用されます-この距離は、初期のゲルの厚さを定義します。さらに、ゲルの厚さは、機械的に安定した状態が達成された実験の最後に測定する必要があります。

アクトミオシンネットワークが多孔弾性材料として振る舞うことを示すには、いくつかの基準を満たす必要があります:(i)ネットワークはリモデリングせず、弾性材料として振る舞うと推測されます(図4)、(ii)ゲル細孔を横切る水(溶媒)の流れはミオシン収縮性によって駆動されます(図5)、および(iii)弾性応力緩和は有効な拡散定数によって特徴付けられます。 D~κ/γは、ゲルの有効弾性率κと、移動する溶媒とゲルの細孔との間の摩擦を説明する有効摩擦定数γに依存します(図6)。 以下では、各基準を個別に説明し、現在のシステムでそれらがどのように満たされているかを示します。

ねらい(i)

まず、ゲル構造と多孔性を分析し、ネットワークが動的にリモデリングしているかどうかを判断する必要があります。アクトミオシンネットワークの概略図を図4Aに描く。ネットワーク形成は、アクチンフィラメントの自発的な核生成と重合から始まり、その後バンドルされます(図4B)。その後、ネットワークは積極的に自己組織化し、アクチンバンドルの巨視的に等方的な相互接続されたネットワークになり、時間とともに動的に粗くなり、最終的には収縮します。ネットワークの自己組織化と収縮は、主にフィラメント束の交点で局在するミオシン凝集体によって駆動されます(図4C)。ミオシン凝集体はゲル収縮によってネットワークに付着したままであり、これらのアクトミオシンゲルは弾性活物質として振る舞うと結論付けることができます(図4C)。さらに、これらのアクトミオシンゲルでは、フィラメント束の端から端までの距離、l端から端まで、および輪郭の長さを比較することによって推定されるように、収縮はフィラメントの滑りによって支配されます(図4D、E)。これは、アクチンフィラメント座屈によって支配されるα-アクチニンによって架橋された緩いアクチン束の収縮とは対照的である29。

ゲルの多孔性は、溶媒の流れが移動するゲル細孔の大きさによって特徴付けられる。精製されたアクチンネットワークの場合、ゲル(ここではミオシン凝集体)内の架橋間の距離を定義するメッシュサイズは、ゲルの孔径の良好な推定値も提供します。メッシュサイズは、(2D)蛍光画像から直接抽出することができ、ゲル孔内の対向するアクチン束のペア間の距離の幾何平均から評価されます(図4B)。ネットワークは収縮開始まで等方性であるため、垂直方向(すなわち、厚さ全体)と横方向(半径に沿って)の平均メッシュサイズは同じであり、ξ0、=ξ0、ll=ξ0(= 67μm)です。 アクチン束は収縮中もまっすぐであるため、メッシュと細孔サイズはゲルの厚さと直径の変化に比例して収縮します。現在の実験システムでは、垂直収縮が実質的に終了した後に面内(半径方向)収縮が開始され(図示せず)、半径方向の収縮は初期厚さよりも~0.3倍小さい一定のゲル厚さで進行する。その結果、収縮面内のメッシュサイズξll(t)= r(t)/Rは半径方向の収縮中に減少するが、r(t)は時間tにおけるゲルの半径であり、垂直方向の平均メッシュサイズは一定であり、ξ= 20μm23である。メッシュ/細孔サイズのこれらの値は、以下に詳述するように、ゲル弾性率κ、および摩擦係数γを評価するために使用されます(目的[iii]、図6)。

ねらい(2)

この目的は、ミオシン収縮性によって外向きの溶媒流が生成されることを実証することを含む。溶媒の流れを追跡するために、蛍光ビーズをアクトミオシン溶液に添加します。ビーズは不動態化され、移動するビーズとアクトミオシンネットワークとの間の相互作用を減少させる。全体として、1 μLのビーズ(材料表)を5 μmのG-アクチンとともに室温で20分間インキュベートし、遠心分離によって過剰なG-アクチンを除去します(材料表、詳細についてはプロトコルのセクションを参照してください)。このステップを10 mg・mL-1 BSA(材料表)で繰り返します。ビーズは、1:10,000 v/vの最終希釈でタンパク質溶液に添加されます。目的はビーズがゲル細孔を自由に移動できるようにすることであるため、ビーズの直径をゲル細孔サイズに適合させて、サイズ比が常に<<1になるようにすることが重要です。そのため、平均細孔径が15μmを超える場合は直径2,300 nmのビーズを使用して収縮の初期段階と中間段階を解析し(図5A、B)、細孔径が小さい場合は直径200 nmのビーズを使用します(図5D-G)。ビーズの重心位置は、標準的な粒子追跡アルゴリズム(材料表)を使用して、時間t、(x(t)、y(t))ビーズごとに抽出され、そこから軌道(図5B)と局所ビーズ速度を推定できます。 粒子像流速測定(PIV)分析から示されているように、ビーズ、したがって浸透溶媒は平均して外向きの半径方向に移動し(図5A、B)、ゲルは内側に収縮します(図6Aの緑色の矢印を参照)。この半径方向の動きは、局所ビーズの半径方向速度νrを抽出することによってさらに詳しく説明することができ、これは局所ビーズ速度をユニティベクトルによって定義される半径方向に投影することによって評価され、ゲル中心(x 0,y0)と時間tにおけるビーズ重心位置を接続します。

データは、ビーズがゲルの中心から外側に移動するにつれて、それらの速度は最初に増加し、その後、ゲル境界に近づくにつれて減速することを示しています(図5C)。特に、ビード速度はゲル半径方向収縮速度の20倍になる可能性があります( 図5Cの青い曲線)。塗りつぶされた円は、ビーズがゲルを離れる時間を示します。ビーズは、ゲル境界を出た後もしばらく動き続けます。レイノルド数は<10-4であるため、この動きは慣性効果から生じることはできません。半径方向のビーズ速度は、ゲル収縮の減少に伴って時間とともに減少します。特に、ゲルの半径方向の収縮速度が大幅に低下すると、ビーズの速度が大幅に変動します。

これらの変動がアクトミオシンの多孔質構造に起因するかどうかをテストするために、ネットワークは、ゲルの収縮が大幅に減速した場合に可能な、より高い空間分解能でビーズの動きを追跡します(図5D-F)。ビーズの軌道は確かに曲がりくねっており(図5D、E)、ビーズの局所速度に大きな変動があり、これはゲルの多孔質構造を反映しています-つまり、局所速度は細孔中心の近くで最も速く、アクチン束の近くで最も遅くなります(図5F)。

最後に、ゲル速度-溶媒速度相関関数を計算することは、局所的に流体の流れが収縮するゲルと反対を向いていることを示しています。ゲル内の局所的な輝点を基準マーカーとして使用して、各時点t、(x(t)、y(t))ゲルの重心位置を計算し、局所的なゲル速度を導き出すことができます。 次に、各ビーズとゲル内の近くの点について、局所ビーズ速度-ゲル速度ペアの相関を計算して、2つのベクトル間の角度θを抽出します。 このデータは、ゲル孔内のビーズの位置とは無関係に、局所的に、流体の流れがゲルに対して反対方向に向けられることを示している(図5G)。全体として、結果は、多孔弾性活物質3、7、23、30について予想されるように、ミオシン収縮性によって外向きの流体の流れが生成されることを示している。

ねらい(3)

この目的は、応力緩和が、ネットワーク弾性率、多孔性、および溶媒粘度に依存する有効な多孔弾性拡散定数Dによって特徴付けられることを実証することを含みます。まず、収縮ゲルの横方向(面内)速度が定量化される(図6A)。まず、蛍光画像を二値化し、各時点tにおけるゲル投影面積A(t)を抽出する。次に、ゲル半径が計算 される(図6B)。このことから、時点tにおける半径方向収縮速度、、ゲルエッジ速度を記述するものが導出される(図6C)。エッジ速度は、時間tmaxで最大速度νmaxに達するまで、エッジ速度が一定の速度で増加する初期線形位相によって特徴付けられる典型的な時間的進化プロファイルを示します。その後、速度は、機械的に安定した状態に達するまで、特徴的な緩和時間τで指数関数的に減衰します(図6C)。rmaxは、その緩和相の開始時のゲル半径である。 

多孔弾性材料の場合、緩和時間 ここで、 は有効多孔弾性拡散定数、κ は有効弾性ゲル弾性率、γはアクチンゲル細孔を通る水溶液の移動を説明する有効摩擦定数である。弾性率は、単位体積当たりのエネルギーの単位を有し、ゲル中の単位格子の体積に反比例し、架橋間の距離またはメッシュサイズによって決定される。摩擦係数γは、溶媒の流れに垂直な細孔ファセットに依存します。面内ゲル収縮の場合、関連する細孔ファセットは であり、したがって摩擦係数であり、ηは溶媒粘度31,32です。全体として、次の関係が得られます:ここで、関連する面内細孔サイズはtmaxで評価されます。全体として、我々は、緩和時間が溶媒粘度23に対して直線的にスケーリングするはずであると推測する。

この関係が守られているかどうかを試験するために、異なる量のグリセロールを用いて実験を繰り返す。グリセロールの使用は、タンパク質、特にミオシンモーターの活性に影響を与えるとは予想されないので有利である。さらに、水−グリセロール溶液の粘度とグリセロールの添加量との間の相関は、文献28に利用可能である。これらの相関は、グリセロール重量パーセントが0%から34%に増加すると、水-グリセロール溶液粘度がηωから2.76ηωに比例して増加し、ηωは20°Cでの水の粘度であることを示しています。 このグリセロール範囲で、同じ初期液滴直径(2R = 2,800 μm)の場合、粘度の増加はネットワーク重合相と自己組織化相の持続時間を増加させますが、線加速度と最大半径方向収縮速度(νmax)はほとんど変化しません。この証拠は、ネットワークの再編成(多孔性)とミオシン活性の両方が溶液粘度23の影響を受けず、溶媒粘度の影響が弾性応力が緩和するのにかかる時間に本質的に反映されるべきであることを示唆しています。実際、緩和時間は溶液粘度に線形依存性を示し(図6D)、これは上記で導出されたスケーリング関係が従うと推測し、システムの多孔弾性特性をさらに確認する。

図1:ガラスカバーガラス表面処理手順の3つの主要なステップの概略説明 。 (i)ガラス表面の洗浄(ピラニア処理)と親水化、(ii)表面のシラン化、および(iii)mPEG-malによる不動態化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ガラスカバースリップパッシベーション。 (A)ピラニアの洗浄とシラン化は、12個の線状溝からなる自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダーを使用して、400 mLビーカーで実行されます。(B)表面パッシベーションは、パラフィルムでコーティングされたペトリ皿で行われます。各カバーガラスを1 mLの5 kDaのmPEG-mal、4mg·mL−1 、1x PBS(材料表)中で22°Cで1時間インキュベートします。 疎水性パラフィルム層は、親水性PEGポリマー溶液がインキュベーション時間を通してガラス表面に閉じ込められたままであることを保証します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:実験の実行-自家製のサンプルホルダー。 実験は、標準的な顕微鏡ステージの寸法に適合する自家製のサンプルホルダーで行われます。(A)厚さ h (~150μm)のグリースを塗ったパラフィルムスペーサーをPEG不動態化カバースリップの上に置き、そのカバースリップをサンプルホルダーに入れます。(B)アクトミオシン溶液をエッペンドルフチューブの氷上で調製し、その溶液1.1 μLをカバーガラスに置きます。次に、(C)2番目のPEG不動態化カバースリップをその上に置き、(D)サンプルホルダーをねじ込んでドロップを閉じ込め、ディスクのような形状を採用します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:目的(i)の多孔弾性。 アクトミオシンネットワークは弾性材料として振る舞う。(A)アクトミオシンネットワークの模式図。(B)アクトミオシンネットワーク形成。蛍光顕微鏡画像は、アクチンフィラメントが自発的に核形成して等方性の相互連結ネットワークに重合し、時間とともに粗大化し、最終的には巨視的に収縮することを示しています。ネットワークの空隙率は、ネットワークメッシュサイズξ(二重矢印)によって特徴付けられます。(C-E)アクトミオシンネットワークの収縮は、アクチンフィラメントバンドルのスライドによって駆動される。(C)ネットワーク収縮はゲル周辺(「P」)で始まり、ゲルバルク内に内向きに伝播します。白い矢印は収縮の方向を示しています。ゲルの中心は「C」でマークされています。蛍光画像は、ミオシンモーター凝集体(561 nm、赤い点)がアクチンネットワーク(488 nm、緑)に埋め込まれ、ネットワーク収縮の間ずっとそれに付着したままであることを示しています。(D)アクチンフィラメントバンドルは、ネットワーク収縮中にまっすぐなままです。時間の関数としての等高線の長さ lcont と端から端までの距離 lの端から端までの比率。(E)t = 316 s(赤一色)およびt = 327 s(縞模様、灰色)での輪郭長と端から端までの距離の比率の分布。挿入図:典型的なバンドルの輪郭の長さ(青)と端から端までの距離(白)。条件:(B、C、E[挿入]):EMCCDカメラと10倍/0.3 PH1 UPlanFL空気対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡で、通常モード(B)および画像オーバーレイ後のデュアルイメージングモード(C、E[挿入])で画像を取得します。スケールバーは(B、C)100μmおよび(E[挿入])50μmです。この図は、Ideses et al.23の許可を得て複製されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:多孔弾性の目的(ii)。 ミオシンの運動収縮性によって外向きの溶媒流が発生します。(A)収縮の中間段階での低倍率でのゲルのイメージング:収縮するアクチンネットワーク(488 nm、左)と溶液に添加した2,300 nmの蛍光ビーズ(561 nm、右)の同時蛍光イメージングを時間の関数として。円は4つのビーズの位置を示します。矢印はビードモーションのグローバル方向を示します。(B)選択された9つのビーズの軌跡が描かれています。矢印は、ビーズの動きのグローバルな半径方向を示します。丸で囲まれた十字は、ゲル中心(x0,y0)(C)局所半径ビーズ速度νr(白丸)および(半径方向)ゲルエッジ速度(青い点)対時間を示す。塗りつぶされた円は、特定のビーズがゲル境界を出る時間を示します。(D-F)収縮の進行段階でのネットワーク多孔性とゲル細孔を横切る溶媒の移動を分解します。(d)溶液に添加した収縮ゲルと直径200nmの蛍光ビーズの落射蛍光画像。アクチンとビーズの両方が488 nmで励起されます。赤い円は、時間とともにビーズの位置に従います。灰色の線はゲル境界を示す。(E)(D)に示すビーズの軌跡。示されているフィールドでは、ゲルは平均して底に向かって収縮します。座標は、カメラの原点を基準にして計測されます。(F)ビーズの局所速度は、ゲルの多孔質構造を反映しています。上:局所的なビード速度(白丸)、局所的なゲル速度(灰色の円)、およびゲルエッジ速度(青い円)の時間に対する。下:スナップショットには、選択した時間のビードの位置が表示されます。ビーズは赤い円でマークされています。破線は、ビーズがゲルから出る時間を示します。(G)局所ゲルと局所ビーズ速度の間の角度の分布。条件:EMCCDカメラと(A)2.5倍/0.075倍のプラン-NEOFLUAR対物レンズと(D,F)10倍/0.3倍のPh1 UPlanFL対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡で画像を取得しました。スケールバーは、(A)400μm、(D)100μm、(F)および50μmである。この図は、Ideses et al.23の許可を得て複製されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:多孔弾性の目的(iii)。 応力緩和は、有効な多孔弾性拡散定数によって特徴付けられる。(A)混合時間から定常状態までの低倍率での収縮アクトミオシンゲルの上面蛍光画像。速度フィールド(緑色の矢印)は、PIV解析から抽出されます。画像は、EMCCDカメラと2.5倍/0.075 Plan-NEOFLUAR対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡で取得されます。励起波長は488nm(アクチン)である。スケールバーは500μmです。 (B)ゲル半径および(C)半径方向収縮速度( すなわち、時間に対するゲルエッジ速度)。 Aは加速度、Vmax は最大速度、τは特徴的な緩和時間を示す。(d)アクトミオシンネットワークは多孔弾性活物質として振る舞う。 溶媒粘度を、 η、対グリセロール重量パーセント(wt%)とする。量は、0 重量% グリセロールでの値に正規化されます。ゲルの初期半径は R = 1,400 μmです。エラーバーは、実験値の標準偏差です。この図は、Ideses et al.23の許可を得て複製されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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