患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

乳がん(BC)は女性で最も一般的に発生する悪性腫瘍であり、2022年に米国で287,850人の新しい症例が診断されると推定されています¹。毎年のスクリーニング、標的療法、および遺伝的素因のより良い理解による早期発見の最近の進歩にもかかわらず、それは米国の女性の癌による死亡の2番目に多い原因であり、年間>40,000人の乳がんで死亡しています¹。乳がんは現在、原発腫瘍の組織病理学的および分子的評価に基づいて複数のサブタイプに分類されています。より良いサブタイプの層別化は、サブタイプ固有の^{治療オプション2}で患者の転帰を改善しました。たとえば、HER2が癌原遺伝子³として同定されたことで、トラスツズマブが開発され、この非常に攻撃的なサブタイプがほとんどの患者で管理可能になりました⁴。この複雑な疾患の遺伝学とトランスクリプトミクスを患者固有の方法でさらに研究することは、より良い患者固有の個別化治療レジメンの開発と予測に役立ちます^2,5。患者由来オルガノイド(PDO)は、分子レベルでがんに関する洞察を得て、新しい標的またはバイオマーカーを特定し、新しい治療戦略を設計するための有望な新しいモデルです^6,7,8。

PDOは、新たに切除された一次組織サンプルに由来する多細胞、三次元(3D)構造である^8,9。それらは、典型的には細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の組み合わせで構成されるヒドロゲルマトリックスに埋め込まれることによって三次元的に増殖するため、腫瘍細胞とECM相互作用の研究に使用できます。PDOは患者の多様性を表し、腫瘍の細胞の不均一性および遺伝的特徴を再現する^10、11、12。インビトロモデルであるため、遺伝子操作とハイスループット薬物スクリーニングが可能になります^13,14,15。さらに、PDOは、臨床と並行して患者の薬物感受性および治療戦略を評価し、患者の転帰を予測するのを助けるためにもっともらしく利用することができる¹⁶、^17、18。化学療法に加えて、特定のオルガノイドモデルも、化学放射線に対する個々の患者の反応を調べるために使用されています^19,20。PDOの研究および臨床使用への有望な適用性を考慮して、国立がん研究所は、これらの腫瘍由来の新規がんモデルを生成および提供するために、国際コンソーシアムであるヒトがんモデルイニシアチブ(HCMI)²¹を開始しました。HCMIを通じて開発されたさまざまながんタイプのオルガノイドモデルの多くは、American Type Culture Collection(ATCC)²²から入手できます。

正常な乳房オルガノイドは、乳腺に存在する異なる上皮細胞集団で構成されていることが示されている^11,23ため、基本的な生物学的プロセスの研究、腫瘍形成を引き起こすドライバー変異の分析、および癌起源細胞系統研究のための優れたモデルとして役立ちます^6,15。.乳房腫瘍オルガノイドモデルは、特に耐性腫瘍に対する新しい治療法の開発の見通しを奨励する新しい標的を特定するために使用されています²⁴、^25、26。Guillenらは、治療抵抗性乳房腫瘍の患者由来異種移植片(PDX)モデルおよびPDX由来オルガノイド(PDxO)モデルを用いて、オルガノイドが精密医療の強力なモデルであり、薬物反応の評価と直接治療の決定を並行して行うことができることを示した²⁸。さらに、様々な免疫細胞^27,28,29、線維芽細胞^30,31および微生物^32,33とPDOを培養するための新しい共培養法の開発は、癌の進行に対する腫瘍微小環境の影響を研究する機会を提供する。膵臓または結腸直腸腫瘍に由来するPDOについては、このような共培養法が活発に確立されているが、乳房PDOに対する同様の確立された共培養法は、ナチュラルキラー細胞³⁴および線維芽細胞³⁵についてのみ報告されている。

異なる乳がんサブタイプを表す>100の患者由来のオルガノイドの最初のバイオバンクは、Hans Cleversグループ^36,37によって開発されました。この取り組みの一環として、Cleversグループは乳房オルガノイド増殖のための最初の複雑な培養培地も開発し、現在広く使用されています³⁶。追跡調査では、乳房PDOおよび患者由来のオルガノイド異種移植片(PDOX)の確立と培養に関する包括的な説明が提供されました³⁸。ウェルム研究所は、ウシ胎児血清(FBS)とより少ない成長因子を含む比較的単純な増殖培地で培養されるBC PDXモデルとPDxOの大規模なコレクションを開発しました^39,40。私たちは、ナイーブな患者由来の乳がんオルガノイドモデル¹¹を独自に開発および特性評価し、HCMIイニシアチブ²¹の一環としてBC PDOモデルの開発に参加しました。ここでは、患者由来の乳房オルガノイドモデルシステムを生成する際に採用されている方法論を詳述した実用的なガイドを提供することを目指しています。

乳がん患者からの腫瘍切除は、遠位および隣接する正常組織とともに、治験審査委員会のプロトコルIRB-03-012およびIRB 20-0150に従って、患者からの書面によるインフォームドコンセントとともに、ノースウェルヘルスから取得されました。

注:下記のすべての手順は、バイオセーフティ委員会の承認を得て、患者サンプル用に指定された哺乳類組織培養BSL2室で実施されました。すべての手順は、バイオセーフティキャビネット内の無菌状態を維持する安全プロトコルに従って実行する必要があります。各遠心分離工程は、特に断らない限り室温(RT)で行われる。組織/オルガノイドおよび基底膜マトリックスストックは、特に明記されていない限り、常に氷上に置かれます。新しいプレートを予熱のために一晩インキュベートします。 事前に温めたプレートにドームをメッキすると、メッキ中に平らにならない丸みを帯びたドームを得るための最良の結果が得られます。

1.培地の準備とレシピ

1. 下記のようにR-spondin1馴化培地を調製する(あるいは市販品を購入することもできる)。
   1. ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%FBS、5%ペニシリン-ストレプトマイシン、および300 μg/mLゼオシン補給の有無にかかわらず、2つの別々の増殖培地を準備します。
   2. HEK293T-HA-Rspondin1-Fc細胞(スタンフォード大学のCalvin Kuoの研究室から入手し、市販されている)のバイアルを、15 mLの培地を含む75 cm² の組織培養フラスコで解凍します。
   3. 細胞を2 x 175 cm² の培養フラスコに分割し、それぞれにゼオシンを含む35 mLの培地を入れます。
   4. 細胞を再度継代して、R-spondin1馴化培地の所望のバッチを生成するのに必要な数のフラスコを得る。ゼオシンを含まない増殖培地を使用してください。
   5. ゼオシンを含まない培地を含むフラスコがコンフルエントになったら、増殖培地を取り出し、Ad-DF+++と交換します(ステップ1.2; 表 1)。細胞を5%_CO2 を含む37°Cのインキュベーターに1週間入れます。
   6. 培地を400 x g で5分間スピンダウンして、付着していない細胞を取り除きます。0.22 μmのフィルターで培地をろ過します。25 mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します(最大6か月間保存できます)。
   7. HEK293T細胞を使用して、市販のDNAトランスフェクション試薬を希釈剤DMEM(高グルコース、ピルビン酸)との試薬対DNA比で4.8:1で使用して、デュアルルシフェラーゼTOPFLASH^41,42アッセイを実行します。100 μLのR-spondin1コンディショニング培地(またはネガティブコントロールの場合は基礎培地)を100 μLのトランスフェクト細胞に加えます。次に、製造元のプロトコルに従ってデュアルルシフェラーゼアッセイを実行し、R-spondin1馴化培地のWnt活性を検証します。
      注:このアッセイでは、ホタルルシフェラーゼ活性読み出しのTOPプラスミドを使用し、FOPプラスミドをネガティブコントロールとして使用します。
2. 基礎培地(Sachsらによって以前に発表されたように、Ad-DF+++培地)を準備する³⁶。

   試薬	在庫濃度	最終濃度
   アドバンスト DMEM/F12	1倍速	1倍速
   グルタマックス	100倍	1倍速
   ヘペス	1メートル	10ミリメートル
   ペニシリン-ストレプトマイシン	10,000 U/mL;10,000 μg/mL	100 U/mL;100 μg/mL

   
   表1:基礎Ad-DF+++培地組成。
3. Sachsらによって以前に発表されたように、患者由来の乳房オルガノイドのための完全な培地を調製する³⁶。

   試薬	在庫濃度	最終濃度
   Ad-DF+++ ミディアム	1倍速	1倍速
   R-スポンジン社内	100%	10%
   B-27サプリメント	50倍	1倍速
   ニコチンアミド	1メートル	5ミリメートル
   ティッカー	500ミリメートル	1.25 ミリメートル
   プリモシン	50ミリグラム/ミリリットル	50 μg/mL
   頭	100 μg/mL	100 ng/mL
   ヒトEGF	5 μg/mL	5 ng/mL
   ヒトヘレグリンβ1/ニューレグリン1	75 μg/mL	37.5 ng/mL
   Y-27632 二塩酸塩(Rho-キナーゼ)	100ミリメートル	5 μM
   A83-01	5ミリメートル	500 nM
   ヒトFGF-7	100 μg/mL	5 ng/mL
   ヒトFGF-10	1ミリグラム/ミリリットル	20 ng/mL
   p38i	30ミリメートル	498 nM

   
   表2:患者由来の乳房オルガノイドのための完全な培地組成物。
4. 必要量のコラゲナーゼIV粉末を秤量し、Ad-DF+++基礎培地に可溶化することにより、2 mg/mLのコラゲナーゼIV溶液を調製します。使用前に0.22μmのフィルターでろ過してください。
5. 希釈剤として1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を使用して、7.5%ストック溶液から0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を調製します。使用前に0.22μmのフィルターでろ過してください。

2. 切除組織からの乳房腫瘍/正常オルガノイドの樹立(図1)

1. 外科的に切除された乳房腫瘍/正常組織標本を、Ad-DF+++を含む50mLのコニカルチューブでラボに輸送します。分離が始まるまでチューブを氷上に保管してください。
2. 地下膜マトリックスのボトルを氷上または4°Cで一晩解凍します。
3. 切除した組織を10 cmの滅菌ペトリ皿に移します。組織を肉眼的に調べ、形態学的に脂肪、血管新生、または壊死しているように見えるかどうかをメモします。さらに、組織のサイズと形状を記録します。理想的には、定規を視野に入れて組織の写真を撮ります(図2)。
4. 滅菌済みの10号メスで組織を非常に小さな断片(~1 mm³)にミンチし、50 mLのコニカルチューブに移します。
5. 10 mLの2 mg / mLコラゲナーゼIV溶液を加え、チューブを透明フィルムで密封します。チューブを37°C、140rpmのオービタルシェーカーに30〜90分間、角度を付けた位置(~30°の角度)で置きます。
6. インキュベーション中、完全培地のアリコートを37°Cのビーズ/水浴に予め温めます。
7. 15分ごとに、5 mLの滅菌血清学的ピペットを使用して激しく上下に混合することにより、組織を再懸濁します。サンプルがピペットに付着することによる組織損失を防ぐために、0.5%BSA溶液でピペットをプレコートします。顕微鏡下で円錐管を5倍以上の倍率で観察することにより、時間の経過に伴う解離を監視します。
8. 組織が解離したら、400 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、10 mLのAd-DF+++を加え、400 x g で5分間遠心分離します。
9. 上清は慎重に捨ててください。ティッシュペレットは時々緩むことがあるので、吸引するときは注意してください。手順をもう一度繰り返します。
10. 組織ペレットが部分的に赤色の場合は、2 mLの赤血球溶解バッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。これは細胞の生存率を著しく低下させるので、より長くインキュベートしないでください。
11. 10 mLのAd-DF+++をチューブに加え、400 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットを50〜300μLの希釈されていない冷たい基底膜マトリックスに再懸濁し、気泡が形成されないように慎重にピペッティングして混合します。
    注:添加される基底膜マトリックスの体積は、ペレットサイズによって異なります。不明な場合は、再懸濁したペレットから~10 μLの小さなドームをプレートし、顕微鏡でコンフルエンシーを観察します。必要に応じて基底膜マトリックスを追加して調整します。基準播種密度については、 図3 (1日目の画像)を参照してください。
12. オルガノイドを含む基底膜マトリックスドームのプレート300 μLを、予め加温し、標識した6ウェル組織培養プレートの各ウェルに入れます。異なるプレートを使用する場合の推奨される基底膜マトリックスと培地容量については 、表3 を参照してください。

    プレートあたりのウェル数	ドームあたりの基底膜マトリックス(μL)	ウェルあたりの培地(μL)
    6	300	3000
    12	100	1000
    24	50	500
    48	25	250
    96	10(ドームの代わりにサスペンション)	100

    
    表3:プレートサイズに基づいてウェルごとに推奨される基底膜マトリックスと増殖培地の量。
13. プレートをフード内で5分間乱さずに放置してから、地下膜マトリックスドームが完全に固まるまで、37°Cのインキュベーターに20〜30分間注意深く置きます。
14. 3mLの予め温めた完全培地を6ウェルプレートの各ウェルに滴下し、37°Cおよび5%_CO2のインキュベーターに入れる。倒立明視野顕微鏡で5倍の対物レンズを使用してオルガノイドの画像を撮影します。
15. オルガノイドの成長に基づいて4〜8日ごとに培地を補充します。ドームを乱さずに古い培地を注意深く吸引し、事前に温めた新鮮な培地を滴下します。
    注:プロトコルは、切除された腫瘍に由来する乳がんオルガノイドを確立する場合と、切除された健康な乳房組織(同じ患者の隣接する正常な乳房組織または縮小乳房形成術手術から得られた健康な乳房組織のいずれか)に由来する正常なオルガノイドの場合と同じです。

3. 培養における患者由来乳房オルガノイドの継代と増殖

1. 地下膜マトリックスのボトルを氷上または4°Cで一晩解凍します。
2. セルスクレーパーまたは1 mLピペットチップを使用して、地下膜マトリックスドームをウェル内の培地に持ち上げます。
3. ピペットチップを0.5% BSA溶液でプレコーティングし、培地を含むオルガノイドのフローティングドームを、採取するウェルの数に応じて15 mLまたは50 mLのコニカルチューブに移します。300 μLの基底膜マトリックスドームを含む2つ以上のウェルの場合は、50 mLのコニカルチューブを使用してください。1x DPBSを追加して、容量を少なくとも5mLに増やします。
4. チューブを400 x g で5分間回転させます。オルガノイドを含む基底膜マトリックスは底部に層を形成します。上清を除去するために慎重に吸引する。
5. チューブにプールされたウェルの数に応じて、5〜20 mLの1x DPBSを追加します。滅菌済みディスポーザブルピペットに0.5%BSAをプレコートし、DPBS中のオルガノイド基底膜マトリックスペレットを上下にピペッティングして均一に混合します。
6. チューブを400 x g で5分間回転させます。上清を注意深く吸引して廃棄します。
7. 基底膜マトリックスの3倍の容量の細胞解離試薬をチューブに加えます。0.5% BSAコーティングピペットチップを使用して、細胞解離試薬中のオルガノイドを再懸濁します。
8. チューブを37°C、140rpmのオービタルシェーカーに角度を付けた位置で8〜15分間置きます。チューブを5分ごとに顕微鏡で観察して監視し、オルガノイドがより小さなクラスターに分解されていることを確認します。
9. 細胞解離試薬以上の容量で基礎培地(すなわち、Ad-DF+++)を加え、ピペットでオルガノイドを混合します。400 x g でRTで5分間回転させ、オルガノイドペレットを得ました。
10. ペレットに未溶解の基底膜マトリックス内に埋め込まれたオルガノイドが含まれている場合は、ステップ3.7〜3.9を繰り返して、さらに5〜8分間のトリプシン処理を行います。
11. 基底膜マトリックスが溶解していない白色オルガノイドペレットが得られたら、上清を廃棄し、1 mLのAd-DF+++を加えてピペッティングでペレットを再懸濁します。次に、Ad-DF+++を最大10mLまで追加します。
12. 洗浄ステップのために、RTで400 x g で5分間回転します。上清を吸引して廃棄する。
13. 適切な分割比に基づいて、消化されたオルガノイドに必要量の基底膜マトリックスを追加します(これは、成長率に基づいてオルガノイド株ごとに大きく異なります)。播種密度の例については、 図3 (1日目の画像)を参照してください。泡が出ないように、ゆっくりと上下にピペッティングして混ぜます。すぐに氷の上に置きます。
14. 予熱した6ウェルプレートを開いてラベルを付けます。顕微鏡下でコンフルエンシーを観察するために、ウェルの隅に10〜20μLのドームをプレートすることをお勧めします。オルガノイドがコンフルエントである場合、より多くの基底膜マトリックスを添加して分割比を高めることができます。
15. 基底膜マトリックスに再懸濁したオルガノイドの300 μLドームをプレート化します。基底膜マトリックスが溶液中に残るように、複数のウェルをメッキしている間は、チューブを氷上に保ちます。
16. プレートをフード内に5分間置いてから、ドームを乱さずに5%CO₂ を含む37°Cのインキュベーターに慎重に置きます。
17. 20〜30分後、ドームは固まります。3 mLの予熱した完全培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。5〜7日ごとに新鮮な完全培地を追加します。マイコプラズマ汚染を検出するための培養物のルーチンテストを実行します。
    注:乳房腫瘍と正常なオルガノイドの培養プロトコルは同じです。しかし、私たちの経験では、正常なオルガノイドは、減速する前に継代6〜8までよく成長する傾向があります。将来の研究のために、できるだけ多くの早期通過ストックを作成することをお勧めします。

4. 患者由来乳房オルガノイドの凍結

1. オルガノイドの合流ウェルを継代して、任意の基底膜マトリックスを除去する、ステップ3.1〜3.12で述べられているように。
2. 継代前に、オルガノイドのペレットを細胞凍結培地(4°Cで一晩解凍)に、基底膜マトリックス容量200〜300 μLあたり1 mLの培地で再懸濁します。参照用に凍結する前にセルカウントを実行します。少量(少なくとも100 μL)の細胞を分注し、必要に応じてさらにトリプシン処理を行い、単一細胞を取得し、セルカウンターマシンを使用してカウントします。
3. 1 mLの細胞を、オルガノイドライン番号、日付、継代番号で標識された2 mLクライオバイアルに移します。チューブには必ず永久マーカーでラベルを付けるか、クライオラベルを使用してください。
4. バイアルを細胞凍結容器に移し、容器を-80°Cの冷凍庫に移します。一晩インキュベートした後、バイアルは長期保存のために液体窒素貯蔵冷凍庫に移動する準備ができています。

5. 患者由来乳房オルガノイドの解凍

1. 地下膜マトリックスのボトルを氷上または4°Cで一晩解凍します。 Ad-DF+++培地を37°Cで予熱します。 凍結バイアルごとに、9 mLの予熱した培地を15 mLのコニカルチューブに分注します。
2. オルガノイドの凍結バイアルを37°Cのビーズバスに入れて急速に解凍します。70%エタノールをスプレーし、チューブをバイオセーフティキャビネットに移します。
3. オルガノイドの損失を避けるために、ピペットチップを0.5%BSA溶液ですすいでください。解凍したオルガノイドを上下にピペッティングして穏やかに混合し、チューブ内の沈降したオルガノイドを混合します。
4. 1 mLの凍結オルガノイドを9 mLの予熱したAd-DF+++に滴下して穏やかに移します。細胞を400 x g で5分間回転させ、上清を注意深く廃棄します。
5. オルガノイドペレットに10 mLの新鮮な予熱したAd-DF+++を加えてペレットを洗浄し、0.5%BSAでプレコートしたピペットで穏やかに混合してペレットを再懸濁します。細胞を400 x g で5分間回転させ、上清を注意深く廃棄します。
6. オルガノイドペレットを氷上に置き、小容量のピペットチップを使用して残りのAd-DF+++を注意深く取り除きます。ペレットを300 μLの基底膜マトリックスに再懸濁し、予め温めた6ウェルプレートにプレートします。プレートを5%_CO2を含む37°Cのインキュベーターに入れる。
   注:顕微鏡下でコンフルエンシーを識別するために、再懸濁されたペレットから10 μLの小さなドームをウェルの隅にプレートすることをお勧めします。オルガノイドがコンフルエントに見える場合は、300 μLの基底膜マトリックスを加えて希釈し、6ウェルプレートの2つのウェルにプレートします。
7. 20〜30分のインキュベーション後、3 mLの予熱した完全培地を固化したドームに加えます。

我々は、様々なサブタイプ11を含む患者由来乳房腫瘍オルガノイドのバイオバンクを確立した。さらに、 図1で概説したアプローチを使用して、BC患者の還元性乳房形成術組織サンプルまたは隣接/遠位正常乳房に由来する複数の正常乳房オルガノイドラインを確立しました。

さまざまな患者由来の乳房腫瘍オルガノイド株は、その形態(図2)と成長率(図3)が異なります。正常な乳房オルガノイド、および私たちが確立したいくつかの初期の乳管癌in situ(DCIS)由来のオルガノイドは、乳管細胞に囲まれた中央内腔を持つ正常な乳房構造に似ています(図2A、B)。浸潤性小葉癌に由来するオルガノイド(図2C)は、他の研究室で以前に報告されたように、緩く付着したブドウの房のような構造を形成する傾向があります36,43。一方、浸潤性乳管癌(ホルモン受容体陽性およびトリプルネガティブ乳癌)に由来するオルガノイドは、高密度で大きく丸いオルガノイドを形成する傾向があります(図2D、E)。オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドで固定した後、2%アガロースモールドに包埋しました。次に、それらをパラフィン包埋し、10μm切片をヘマトキシリンおよびエオシン(Bhatiaら11に記載)で染色して形態を観察した。

異なる患者由来の乳房腫瘍オルガノイド株の増殖速度の違いを実証するために、1,000個の生存可能な単一細胞を96ウェルプレートあたり10%基底膜マトリックス懸濁液に播種し、それぞれ6回の反復を行い、異なる時点での細胞生存率を決定し、12日間にわたる増殖をモニターしました(図3B).オルガノイド形成は、3、6、9、および12日目に発光細胞生存率アッセイを使用して測定され、プレーティング後1日目にベースライン測定値が測定されました。 図3A は、6ウェルプレートで経時的に拡大した同じオルガノイドの明視野画像を示しています。患者由来のオルガノイド株には、倍加時間が2日と、5日かかるものがあります(図3B)。

図1:患者由来の乳房オルガノイドの樹立 。 (A)患者由来の乳房腫瘍または正常なオルガノイドを確立するための主要なステップの概略図。(B)DS117T患者由来乳房腫瘍オルガノイドの樹立(継代0)から長期培養(継代12)までの増殖を示す代表的な画像。青い矢印=繊維状物質、黄色の矢印=破片/死細胞、赤い矢印=微小環境(主に線維芽細胞)からの支持細胞タイプ。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:異なるサブタイプを表す患者由来の乳房オルガノイド。上図:異なる組織病理学的および分子サブタイプの患者乳房腫瘍(B-E)に由来するオルガノイド株間の形態学的差異。(A)図は、還元的乳房形成術後に得られた正常ヒト乳房組織由来のオルガノイドを表す。スケールバー= 50μm。下パネル:同じオルガノイドラインのH&E染色画像。スケールバー= 100μm。略称:TNBC =トリプルネガティブ乳がん。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:異なる患者由来の乳房腫瘍オルガノイドの培養における成長。 代表的な明視野画像および細胞生存率曲線(A および B)は、発光細胞生存率アッセイ を介して 測定され、12日間にわたる異なる患者由来乳房腫瘍オルガノイド株の培養における増殖を示す。スケールバー= 50μm。エラーバーはn=6の場合のSEMを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者は利益相反を宣言しません。