in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

カルシウムイオン(^Ca2+)は、多くの細胞型において非常に汎用性の高い情報担体です。ニューロンにおいて、^Ca2+は、神経伝達物質の活動依存的放出、細胞骨格運動性の調節、代謝過程の微調整、ならびに適切なニューロンの維持および機能に必要な他の多くのメカニズムに関与している^1,2。効果的な細胞内シグナル伝達を確実にするために、ニューロンは細胞質³において低い基底^Ca2+レベルを維持しなければならない。これは、小胞体(ER)やミトコンドリアなどの細胞小器官へのCa2+の取り込みを含む、協調的な^Ca2+処理メカニズムによって達成されます。これらのプロセスは、原形質膜におけるCa2+透過性イオンチャネルの配置に加えて、ニューロン全体にわたって不均一なレベルの細胞質^Ca2+をもたらす。

安静時およびニューロン活性化中のCa2+不均一性は、^Ca2+依存性メカニズムの多様で場所特異的な調節を可能にします¹。^Ca2+の濃度特異的効果の一例は、イノシトール1,4,5-三リン酸(_InsP3)受容体を介したERからの^Ca2+の放出である。InsP₃と組み合わせた低^Ca2+レベルは、受容体のカルシウム透過性細孔の開口に必要とされる。あるいは、高い^Ca2+レベルは、受容体⁴を直接的および間接的に阻害する。適切な神経機能のためのCa2+恒常性の重要性は、細胞内^Ca2+の取り扱いおよびシグナル伝達の破壊が神経変性障害および自然老化の病因の初期段階であることを示唆する証拠によって裏付けられ^ている5,6。具体的には、ERおよびミトコンドリアによる異常な^Ca2+の取り込みおよび放出は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病における神経機能障害の発症に関連している^6,7。

自然老化または神経変性中のCa2⁺異相変の研究には、天然の細胞構造(すなわち、シナプスの配置およびイオンチャネルの分布)が維持されている生きている無傷の生物における細胞内分解能での^Ca2+レベルの縦断的観察が必要である。この目的のために、このプロトコルは、高い空間的および時間的分解能でin vivoでCa2+ダイナミクスを記録するために、容易に入手可能で遺伝的にコード化された2つの^Ca2+センサーの使用に関するガイダンスを提供します。C. elegansに記載の方法を用いて得られた代表的な結果は、単一ニューロンの細胞質またはミトコンドリアマトリックスにおけるCa2+指示薬の発現が、単一のスパイン様構造および個々のミトコンドリア内のCa2+レベルを識別する追加能力を有する^Ca2+動態を示す蛍光画像(最大50Hz)の迅速な取得をどのように可能にするかを示している。

1. トランスジェニック株の作製

1. 選択したクローニング法^8,9を用いて、Pflp-18またはPrig-3プロモーター(腹側神経索におけるAVA特異的シグナル用)を含む発現ベクターをクローニングし、続いて選択した^Ca2+指標、次いで3' UTR(詳細についてはディスカッションを参照)¹⁰を含む。プラスミドとそのソースのリストは、補足表1に記載されています。
2. Ca²⁺指示薬導入遺伝子(~20 ng/μL)とレスキューDNA lin-15⁺⁽選択マーカー)を含むDNAミックス(<100 ngμl;各プラスミドの濃度については補足表1を参照)を1日齢の成人C.エレガンス¹⁰(遺伝子型: リン-15 (N765TS);表現型:多外陰部)^10,11。
   手記。 lin-15(n765ts) の親を15°Cに維持して、温度感受性変異を抑制します。
3. F1子孫が成人期に達するまで注射した両親を20°Cに維持し、多外陰部の表現型がないことを使用してトランスジェニック選択を可能にします。
4. クローン継代¹³ は多外陰部表現型を有していない成体F1子孫、^Ca2+ 指示薬¹¹を含む染色体外配列の発現を示す。
5. セクション3で後述するように、1日齢の成人をマウントしてイメージングすることにより、多外陰部表現型を持たないF2またはF3子孫における^Ca2+ インジケーターの発現を評価します。
   手記。ここで説明するように、画像を迅速に取得するには、指標の比較的高い表現が必要です(詳細については、説明を参照してください)。
6. ^Ca2+指示薬を最適発現させてトランスジェニック株のその後の世代で実験を行い(詳細は説明を参照)、標準条件(NGMプレート上で20°C)¹²で菌株を維持します。

2.光学セットアップ

1. 長期間のタイムラプスイメージングが可能な顕微鏡を使用してください。
   手記。代表的なデータは、488nmおよび561nm励起レーザーを備えた倒立スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して取得されました。
2. ワームの大まかな局在化のために、低倍率の対物レンズ(つまり、10x / 0.40)を使用します。
3. 細胞内分解能を達成するには、高倍率対物レンズを使用してニューロンに切り替えて局在化します。
   手記。100x/1.40 NAのオイル対物レンズを使用して、この研究の代表的なデータを取得しました。
4. 高速画像取得(>50fps)が可能な超高感度カメラを使用して画像を取得します。
5. 選択したCa2+インジケーターには標準の発光フィルターを使用してください(GCaMP6fおよびmitoGCaMPには^525nm ±50nmの発光フィルター)。
6. イメージングセッション中に寒天パッドが乾燥すると、神経突起が数秒以内に焦点が合っなくなるため、10秒を超える画像ストリームを取得するためのZドリフト補正器(ZDC)を追加します。
   手記。顕微鏡のセットアップでZDCができない場合、または長い(>20分)イメージング期間が必要な場合は、寒天パッドの周りにシリコングリースまたは溶けたワセリンの境界を塗布して、乾燥を遅らせます。

3.イメージング用のワームの準備

1. 寒天パッドの準備
   1. 分子グレード寒天をM9 12に溶解し、¹³ mm x 100 mmのガラス培養チューブに溶解し、数秒間電子レンジで数秒間電子レンジで、3 mLの10%寒天を作ります(材料の表を参照)。
      手記。溶融寒天は、最大1時間ヒートブロックに保持することも、寒天パッドが必要になるたびに新鮮にすることもできます。
   2. それぞれに2層の実験用テープがある2つの追加のスライドの間に顕微鏡スライドを配置します(図1A-iを参照)。
   3. 1,000 μLのピペットチップ(フィルターなし)の先端を切り取り、それを使用して寒天の小滴を中央のカバースリップにピペットで移します(図1A-i)。
   4. 寒天の上部にある別のスライドを押して寒天を平らにします(図1A-ii)。
   5. 冷却後、13mm×100mmのガラス培養管(図1A-iii)の開口部を用いて寒天を小さな円盤状に切断し、周囲の寒天を取り除きます。
2. ワームローリングソリューションの準備
   1. ムシモール粉末をM9に溶解して、30 mMのストックを作成します。50 μLのアリコートに分離し、4°Cで保存します。
   2. 3〜5日ごとに30 mMムシモールの新しいアリコートを解凍します(使用中は20°Cで保管してください)。
   3. 30 mMのムシモールストックをポリスチレンビーズで1:1の比率で希釈して、圧延溶液を作ります。
3. イメージング用のワームの配置
   1. 1.6 μLのローリング溶液を寒天パッドの中央に置きます。
      注意: 液体の量は、若い(少ない)または年配の動物(多い)を画像化するために調整する必要があります。
   2. 好ましいワームピック(すなわち、ガラスまたはプラチナワイヤーピック)¹³を使用して、多外陰部表現型¹¹ のない所望の年齢のワームを寒天パッド上のローリング溶液に移す(図1A-iv)。
      手記。代表的なデータは、1日齢の雌雄同体(GCaMP6f株= FJH185;mitoGCaMP株;FJH597; 補足表1を参照)、これは1列の卵のみの存在によって識別できます。さまざまな年齢のワームの操作の詳細については、ディスカッションを参照してください。
   3. ムシモールがワームの動きを減らすまで~5分待ってから、寒天パッドの上に22 mm x 22 mmのカバーガラスを落とし、ワームの動きを物理的に制限します。
   4. 腹側神経索の神経突起を画像化するには、カバーガラスを軽くスライドさせて、ワームを 図1B、C に示す方向に転がします。
      手記。腹側神経索を視覚化するには、頭を上にしてワームを配置し、腸が近位部の右側とワームの遠位部分の左側になるまで(視聴者の視点から)ワームを転がします。背側神経索の神経突起を画像化するために、この向きを反転させます(図1C)。
4. ワームを顕微鏡に取り付ける
   1. 顕微鏡ステージに取り付ける前に、カバーガラスに液浸オイルを一滴置きます。
   2. 明視野で低倍率対物レンズ(10倍)対物レンズを使用してワームを見つけます。
   3. 100倍の対物レンズに切り替えて、フォーカスを調整します。
   4. GCaMPまたはmitoGCaMPと488nmイメージングレーザーの照明を使用して、AVA神経突起を見つけます。
      注意: ワームを押しつぶしたり、カバーガラスを引っ張ったりしないように、微調整を使用してください。

4. 高解像度画像ストリームの取得

1. 生体内 GCaMP イメージング
   1. 露光時間を 20 ms に設定します。
   2. 基礎GCaMP蛍光がカメラのダイナミックレンジ¹⁴のミッドレンジになるまで、イメージングレーザーと取得の設定を調整します。他の顕微鏡設定を使用したイメージングパラメータの最適化に関する提案については、ディスカッションを参照してください。
      手記。この研究で使用する光学セットアップでは、488 nmイメージングレーザーを次の出力設定に設定します:レーザー出力= 50%、減衰= 1。追加のアクイジション設定を次のように変更します:EMゲイン= 200およびプリアンプゲイン= 1。
   3. GCaMP蛍光を100倍の倍率で使用してAVA神経突起を見つけたら、ZDC( 材料表を参照)を±30 μmの範囲に設定し、連続オートフォーカスを開始します。イメージングする前に、必要に応じて焦点面を手動で修正します。
   4. 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。この調査で使用したセットアップでは、10分という期間を達成できます。
2. 生体内 マイトGCaMPイメージング
   1. 必要に応じて手順4.1.1〜4.1.2に従って、カメラのダイナミックレンジ¹⁴のミッドレンジで基礎mitoGCaMP蛍光を取得します。
      手記。この研究で使用する光学セットアップでは、488 nmイメージングレーザーを次の出力設定に設定します:レーザー出力= 20%、減衰= 10。集録設定を次のように変更します:EMゲイン= 100およびプリアンプゲイン= 2。
   2. mitoGCaMP蛍光を用いてAVA神経突起中のミトコンドリアが位置特定された後、ステップ3.3で上述したようにZDCを設定する。
   3. 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。

5. 画像ストリーム解析

1. 画像シリーズのピクセル値を分析するための適切な画像ソフトウェアで画像ストリームを開きます(「 材料表」を参照)。
2. ポリゴン選択ツールを使用して、GCaMP または mitoGCaMP を含む細胞内関心領域 (ROI) を定義します。
3. ROIマネージャー>>ツールの分析をクリックします。ROI マネージャーで、[追加]、[その他] > [マルチメジャー] の順にクリックします。[Multi Measure] ウィンドウで [OK] をクリックすると、画像ストリームの各フレームについて上記で定義した ROI の平均、最小、および最大のピクセル強度が自動的に収集され、さらに分析されます。
   手記。平均ピクセル強度(F_avg)は、z 平面内の位置による蛍光の差を考慮して、F_avg/F min の比率を使用して各 ROI の最小強度 (F_min) に正規化することをお勧めします。イメージング中にワームの動きを伴う画像ストリームは、蛍光測定にも影響するため、破棄します。

これら2つのプロトコルにより、in vivoで個々の神経突起の細胞内領域および細胞小器官内の異なるCa2+レベルを高い空間分解能で迅速に取得できます。最初のプロトコルは、高い時間的および空間的分解能で細胞質Ca2+の測定を可能にします。これは、神経突起が腹側神経索の全長を走るグルタミン酸作動性AVAコマンド介在ニューロン15におけるGCaMP6fの細胞特異的発現を用いてここで実証される。GCaMP6f蛍光(50 Hz)を迅速に取得することで、Ca2+流入の方向性伝播を検出することができました(図2Aおよび補足ビデオ1)。GCaMP6f蛍光の細胞内定量により、Ca2+流入の開始がわずか10μm離れた神経突起の一部で遅れることが明らかになりました(図2B)。さらに、このプロトコルは、区画化されたCa2+およびサブスレッショルドCa 2+イベントのいくつかの観察を可能にした。例えば、AVA神経突起に沿って見られる樹状突起スパイン様構造は、神経突起の活性化とは無関係に起こり、Ca2+流入の伝播をもたらさないGCaMP6f蛍光の閃光を有することが見られた(図2C、Dおよび補足ビデオ2)。

第2のプロトコルは、単一神経突起における個々のミトコンドリアにおける相対的なCa2+レベルを迅速に測定することを目的としていた。ミトコンドリアマトリックスに局在するCa2+指示薬mitoGCaMPのAVA特異的発現を有する線虫株を用いることで、AVA神経突起内の個々のミトコンドリアレベルでmitoGCaMP蛍光の変化を迅速に検出することができました。このイメージングプロトコルは、少なくともこのニューロンにおいて、ミトコンドリアへのCa2+取り込みの異なるモードを明らかにした。第1に、図3Aに示す結果は、ミトコンドリアのサブセットへの比較的大量のCa2+の同期取り込みの例を提供する。より具体的には、これらのデータから、一部のミトコンドリアへのCa2+取り込みが同期していることが明らかになりました(Mito1とMito2;図3A,Bおよび補足ビデオ3)に対して、隣接するミトコンドリアはCa2+(Mito3;図3A,B)。同様に、ミトコンドリアのサブセットは、少量のCa2+を急速に取り込み、放出することが見られました。これも同期しているように見えましたが(Mito1とMito3、図3C、D、補足ビデオ4)、やはりミトコンドリアのサブセット(Mito 2、図3C、D)についてのみです。

図1:腹側神経索を画像化するための C.エレガンスの 取り付けとローリング。 (A)寒天パッドを準備し、単一のワームをローリング溶液にピッキングする手順の図。(B)イメージングのために再配置される前のワームの位置の例。赤い矢印は、カバーガラスを右にスライドさせることで達成できるワームの右向きのロールの必要性を示しています(青い矢印)。スケールバー= 50μm。(C)腹側神経索を視覚化するために必要な正しい向き。注:腸は、近位半分の視聴者の右側(正立顕微鏡を使用)にあり、遠位半分の左側にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:AVA神経突起およびスパイン様構造における細胞内分解能によるGCaMP6f蛍光の迅速な取得 。 (A)AVALおよびAVAR神経突起分岐部におけるGCaMP6f蛍光の代表的な画像。スケールバー= 5μm。(B)パネルAの下部画像で定義された近位(オレンジ)および遠位(青)領域について、その領域(Fmin)の最小蛍光(F)に正規化されたGCaMP6f蛍光の定量化。 (C)AVA神経突起の脊椎状突起におけるGCaMP6f蛍光の代表的な画像。(D)パネルCの下部画像の対応する領域からの神経突起(オレンジ色)および脊椎状突起(青色)における正規化されたGCaMP6f蛍光。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.AVA神経突起内の個々のミトコンドリアへのカルシウム取り込みの迅速なイメージング。(A,C)時間の経過に伴うmitoGCaMP蛍光の代表的な画像。スケールバー= 50μm。(B)パネルAの下部画像に示されている対応するミトコンドリアの正規化GCaMP蛍光の痕跡(F / Fmin)。 (D)パネルCの下部画像で強調表示されている領域での40秒間のF / F分。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1:AVA神経突起におけるGCaMP6f蛍光。 ビデオは2倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ2:AVA神経突起上のスパイン様突起におけるGCaMP6f蛍光。 ビデオは2倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ3:AVA神経突起に同期したミトコンドリアカルシウム取り込みにおけるMitoGCaMP蛍光。 ビデオは4倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ4:AVA神経突起におけるMitoGCaMP蛍光-ミトコンドリアによるカルシウムの急速な取り込みと放出。 ビデオは4倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表1:本研究で用いた遺伝子試薬および菌株。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は競合する利益を宣言しません。