本プロトコルは、FeCl3媒介傷害を使用して動脈血栓症を誘発する方法、および電子顕微鏡分析のために血栓症の様々な段階で動脈損傷サンプルを収集して調製する方法を記載している。
心血管疾患は、世界中の死亡率と罹患率の主な原因です。異常な血栓症は、糖尿病や肥満などの全身状態、およびアテローム性動脈硬化症、癌、自己免疫疾患などの慢性炎症性疾患の一般的な特徴です。血管損傷時には、通常、凝固系、血小板、および内皮が調整された方法で作用し、損傷部位に血餅を形成することによって出血を防ぎます。このプロセスの異常は、過度の出血または制御不能な血栓症/不十分な抗血栓活性のいずれかを引き起こし、血管閉塞とその後遺症につながります。FeCl3誘発頸動脈損傷モデルは、血栓症が in vivoでどのように開始および進行するかを調べる上で貴重なツールです。このモデルには、内皮の損傷/露出とそれに続く損傷部位での血餅形成が含まれます。これは、さまざまな程度の血管損傷に応答して血管損傷と血餅形成を監視するための高感度で定量的なアッセイを提供します。最適化されると、この標準的な手法を使用して、血栓症の根底にある分子メカニズム、および成長する血栓における血小板の微細構造変化を研究することができます。このアッセイは、抗血栓薬および抗血小板薬の有効性を研究するのにも有用である。この記事では、FeCl3誘発動脈血栓症を開始および監視する方法、および電子顕微鏡による分析のためにサンプルを収集する方法について説明します。
血栓症は、血管を部分的または完全に遮断し、血液の自然な流れを妨げる血栓の形成です。これは、虚血性心疾患や脳卒中などの重度で致命的な心血管イベントにつながります。心血管疾患は罹患率と死亡率の主な原因であり、世界中で4人に1人が死亡しています1,2,3。血栓症は血管系の機能不全として現れますが、根本的な微生物またはウイルス感染、免疫障害、悪性腫瘍、または代謝状態の結果である可能性があります。血流は、内皮細胞、赤血球/白血球、血小板、凝固因子など、血管系の多様な構成要素間の複雑な相互作用によって維持されています4。血管損傷を受けると、血小板は内皮下マトリックス上の接着タンパク質と相互作用し、それらの顆粒内容物を放出し、より多くの血小板を動員します5。同時に、凝固カスケードが活性化され、フィブリンの形成と沈着につながります。最終的に、血餅が形成され、フィブリンメッシュ6内に閉じ込められた血小板および赤血球を含む。血栓症を調節するために抗血小板薬と抗凝固薬が利用可能であるが、偽の出血は依然としてこれらの治療法の主要な懸念事項であり、これらの薬の投与量と組み合わせの微調整が必要である。したがって、新しい抗血栓薬を発見することが依然として緊急に必要です7。
血栓症は、血管損傷を与えるために複数の方法を使用して研究されています:機械的(血管結紮)、熱的(レーザー損傷)、および化学的損傷(FeCl3 /ローズベンガルアプリケーション)。血栓症の性質は、損傷の場所(動脈対静脈)、方法、または程度によって異なります。これらすべてのタイプの中で、FeCl3誘発血管損傷が最も広く使用されている方法です。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ8、9、10、11、12に採用されています。この方法は比較的簡単で使いやすく、主要なパラメータが標準化されていれば、さまざまな血管系(動脈[頸動脈および大腿骨]、静脈[頸静脈]、細動脈[火葬場および腸間膜]など)で感度と再現性があります(補足表1)。
このモデルは、血餅形成の力学と形態の理解を深めるためにも使用できます。この技術は、血栓症が閉塞する前にプロセスの中間段階を研究するために、さまざまな流速ポイントで血栓症を止めるという独自の利点を提供します。血栓症研究における最近の進歩は、このモデルを使用して、血栓溶解の非薬理学的方法13または抗血栓薬および/または線維素溶解剤の非侵襲的送達に注意を向けている14,15。いくつかのグループは、血小板膜がこれらの治療薬でコーティングされている場合、標的凝血塊への熱刺激により薬物を活性化できることを示した16。ここで説明する手法は、単一血小板レベルでの所見の検証などの研究に役立ちます。この原稿では、プロトコル1は基本的なFeCl3媒介血管損傷手順を説明し、プロトコル2は電子顕微鏡によるさらなる分析のために血管損傷サンプルを収集して固定する方法を説明しています。
血栓症を誘発するための血管系へのFeCl3の局所適用は広く使用されている技術であり、さまざまな血小板受容体、リガンドシグナル伝達経路、およびそれらの阻害剤の役割を確立するのに役立ちました20、21、22、23。FeCl3が血栓症を引き起こすメカニズムは多面的です。以前は、内…
The authors have nothing to disclose.
著者は、この原稿を注意深く熟読してくれたホワイトハート研究所のメンバーに感謝します。この作業は、NIH、NHLBI(HL56652、HL138179、およびHL150818)からの助成金、およびSWWへの退役軍人省功労賞、BSへのR01HL 155519、およびR.D.L.へのNIBIB学内プログラム助成金によってサポートされました。
0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |