本プロトコルは、生体適合性リポソームを生成するためのマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)を記載する。OLAは、効率的なカプセル化を備えた単分散のミクロンサイズのリポソームを生成し、即時のオンチップ実験を可能にします。このプロトコルは、合成生物学および合成細胞研究に特に適していると期待されています。
マイクロフルイディクスは、制御されたハイスループットな方法でさまざまな種類の液滴や小胞を生成するために広く使用されているツールです。リポソームは、脂質二重層に囲まれた水性内部で構成される単純な細胞模倣物です。それらは、合成細胞を設計し、 in vitro 方式で生物学的細胞の基礎を理解する上で価値があり、治療用途の貨物輸送などの応用科学にとって重要です。この記事では、単分散でミクロンサイズの生体適合性リポソームを製造するためのオンチップマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の詳細な作業プロトコルについて説明します。OLAは、内水(IA)相と周囲の脂質担持1-オクタノール相が界面活性剤を含む外液流によって挟まれる気泡吹きと同様に機能します。これにより、オクタノールポケットが突出した二重エマルジョン液滴が容易に生成されます。脂質二重層が液滴界面で集合すると、ポケットは自発的に剥離し、さらなる操作および実験の準備ができている単層リポソームを生じさせる。OLAは、安定したリポソーム生成(>10 Hz)、生体材料の効率的なカプセル化、単分散リポソーム集団など、いくつかの利点を提供し、貴重な生物学的製剤を扱う際に重要な非常に少量のサンプル(~50 μL)を必要とします。この研究には、ラボでOLA技術を確立するために必要な微細加工、ソフトリソグラフィ、および表面パッシベーションの詳細が含まれています。原理実証合成生物学の応用は、膜貫通プロトンフラックス を介して リポソーム内の生体分子凝縮物の形成を誘導することによっても示されています。この付随するビデオプロトコルは、読者がラボでOLAを確立してトラブルシューティングすることを容易にすることが期待されています。
全ての細胞はそれらの物理的境界として原形質膜を有し、そしてこの膜は本質的に両親媒性脂質分子の自己組織化によって形成される脂質二重層の形態の足場である。リポソームは、生物学的細胞の最小合成対応物です。それらはリン脂質で囲まれた水性内腔を有し、リン脂質は親水性の頭部基が水相に面し、疎水性の尾部が内側に埋もれている脂質二重層を形成する。リポソームの安定性は、疎水性効果、極性基間の親水性、疎水性カーボンテール間のファンデルワールス力、および水分子と親水性ヘッド間の水素結合によって支配されます1,2。脂質二重層の数に応じて、リポソームは、単一の二重層からなる単層小胞と複数の二重層から構築された多層小胞の2つの主要なカテゴリーに分類することができる。単層小胞は、そのサイズに基づいてさらに分類されます。典型的には球形であり、小さな単層小胞(SUV、直径30〜100 nm)、大きな単層小胞(LUV、直径100〜1,000 nm)、そして最後に巨大な単層小胞(GUV、直径>1,000 nm)を含むさまざまなサイズで製造できます3,4。リポソームを製造するために様々な技術が開発されており、これらはバルク技術5とマイクロ流体技術6に大きく分類することができる。一般的に実施されているバルク技術には、脂質膜の再水和、電鋳、反転エマルジョン転写、および押出7、8、9、10が含まれます。これらの技術は比較的単純で効果的であり、合成生物学コミュニティで広く使用されている主な理由です。しかしながら、同時に、それらは、サイズの多分散性、ラメラリティーに対する制御の欠如、および低いカプセル化効率に関して大きな欠点に苦しんでいる7,11。連続液滴界面交差カプセル化(cDICE)12や液滴撮影およびサイズろ過(DSSF)13などの技術は、これらの制限をある程度克服します。
マイクロ流体アプローチは、過去10年間で注目を集めています。マイクロ流体技術は、特徴的な層流と拡散が支配的な物質移動により、ユーザー定義のマイクロチャネル内の流体の流れを操作するための制御可能な環境を提供します。結果として得られるラボオンチップデバイスは、サンプル量を大幅に削減し、マルチプレックス機能を備え、分子の時空間制御に独自の可能性を提供します14。パルス噴射15、ダブルエマルジョンテンプレート16、一過性膜排出17、液滴エマルジョン転写18、および流体力学的焦点化19を含む、リポソームを作製するための多数のマイクロ流体法が開発されている。これらの技術は、高いカプセル化効率と高いスループットを備えた単分散の単層細胞サイズのリポソームを生成します。
この記事では、流体力学的ピンチオフとそれに続く溶媒デウェッティングメカニズム20に基づくオンチップマイクロ流体法であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の手順について詳しく説明します(図1)。OLAの働きを泡を吹くプロセスに関連付けることができます。6方向ジャンクションは、内水(IA)相、2つの脂質担持有機(LO)ストリーム、および2つの界面活性剤含有外水性(OA)ストリームを1つのスポットに集中させます。これにより、水中水(脂質+オクタノール)の二重エマルジョン液滴が得られます。これらの液滴が下流に流れると、界面エネルギーの最小化、外部せん断流、およびチャネル壁との相互作用により、溶媒ポケットが剥離するにつれて界面に脂質二重層が形成され、単層リポソームが形成されます。オクタノールポケットのサイズに応じて、デウェッティングプロセスには数十秒から数分かかる場合があります。出口チャネルの終わりには、密度の低いオクタノール液滴が表面に浮遊しますが、より重いリポソーム(より高密度のカプセル化溶液による)は、実験の準備ができた視覚化チャンバーの底に沈みます。代表的な実験として、リポソーム内部の液-液相分離(LLPS)のプロセスが実証されています。そのためには、必要な成分がLLPSを防ぐ酸性pHでリポソーム内に封入されています。pH変化、したがって膜貫通プロトンフラックスを外部から引き起こすことによって、相分離凝縮液滴がリポソーム内部に形成される。これは、OLAシステムの効果的なカプセル化および操作機能を浮き彫りにします。
細胞の複雑さは、全体として研究した場合、生細胞を理解することを非常に困難にします。in vitroで主要成分を再構成することによって細胞の冗長性と相互接続性を減らすことは、生物学的システムの理解を深め、バイオテクノロジーアプリケーションのための人工細胞模倣物を作成するために必要です22,23,24。リポソー?…
The authors have nothing to disclose.
ドルフ・ヴァイヤーズ、ヴェラ・ゴレロワ、マーク・ルーシェンがYFPを提供してくれたことに感謝します。S.D.は、オランダ研究評議会からの財政的支援を認めています(助成金番号:OCENW。クライン.465)。
1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
UV laser | 365 nm wavelength |