概要

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

Published: March 17, 2023
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概要

本プロトコルは、生体適合性リポソームを生成するためのマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)を記載する。OLAは、効率的なカプセル化を備えた単分散のミクロンサイズのリポソームを生成し、即時のオンチップ実験を可能にします。このプロトコルは、合成生物学および合成細胞研究に特に適していると期待されています。

Abstract

マイクロフルイディクスは、制御されたハイスループットな方法でさまざまな種類の液滴や小胞を生成するために広く使用されているツールです。リポソームは、脂質二重層に囲まれた水性内部で構成される単純な細胞模倣物です。それらは、合成細胞を設計し、 in vitro 方式で生物学的細胞の基礎を理解する上で価値があり、治療用途の貨物輸送などの応用科学にとって重要です。この記事では、単分散でミクロンサイズの生体適合性リポソームを製造するためのオンチップマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の詳細な作業プロトコルについて説明します。OLAは、内水(IA)相と周囲の脂質担持1-オクタノール相が界面活性剤を含む外液流によって挟まれる気泡吹きと同様に機能します。これにより、オクタノールポケットが突出した二重エマルジョン液滴が容易に生成されます。脂質二重層が液滴界面で集合すると、ポケットは自発的に剥離し、さらなる操作および実験の準備ができている単層リポソームを生じさせる。OLAは、安定したリポソーム生成(>10 Hz)、生体材料の効率的なカプセル化、単分散リポソーム集団など、いくつかの利点を提供し、貴重な生物学的製剤を扱う際に重要な非常に少量のサンプル(~50 μL)を必要とします。この研究には、ラボでOLA技術を確立するために必要な微細加工、ソフトリソグラフィ、および表面パッシベーションの詳細が含まれています。原理実証合成生物学の応用は、膜貫通プロトンフラックス を介して リポソーム内の生体分子凝縮物の形成を誘導することによっても示されています。この付随するビデオプロトコルは、読者がラボでOLAを確立してトラブルシューティングすることを容易にすることが期待されています。

Introduction

全ての細胞はそれらの物理的境界として原形質膜を有し、そしてこの膜は本質的に両親媒性脂質分子の自己組織化によって形成される脂質二重層の形態の足場である。リポソームは、生物学的細胞の最小合成対応物です。それらはリン脂質で囲まれた水性内腔を有し、リン脂質は親水性の頭部基が水相に面し、疎水性の尾部が内側に埋もれている脂質二重層を形成する。リポソームの安定性は、疎水性効果、極性基間の親水性、疎水性カーボンテール間のファンデルワールス力、および水分子と親水性ヘッド間の水素結合によって支配されます1,2。脂質二重層の数に応じて、リポソームは、単一の二重層からなる単層小胞と複数の二重層から構築された多層小胞の2つの主要なカテゴリーに分類することができる。単層小胞は、そのサイズに基づいてさらに分類されます。典型的には球形であり、小さな単層小胞(SUV、直径30〜100 nm)、大きな単層小胞(LUV、直径100〜1,000 nm)、そして最後に巨大な単層小胞(GUV、直径>1,000 nm)を含むさまざまなサイズで製造できます3,4。リポソームを製造するために様々な技術が開発されており、これらはバルク技術5とマイクロ流体技術6に大きく分類することができる。一般的に実施されているバルク技術には、脂質膜の再水和、電鋳、反転エマルジョン転写、および押出7、8910が含まれます。これらの技術は比較的単純で効果的であり、合成生物学コミュニティで広く使用されている主な理由です。しかしながら、同時に、それらは、サイズの多分散性、ラメラリティーに対する制御の欠如、および低いカプセル化効率に関して大きな欠点に苦しんでいる7,11。連続液滴界面交差カプセル化(cDICE)12や液滴撮影およびサイズろ過(DSSF)13などの技術は、これらの制限をある程度克服します。

マイクロ流体アプローチは、過去10年間で注目を集めています。マイクロ流体技術は、特徴的な層流と拡散が支配的な物質移動により、ユーザー定義のマイクロチャネル内の流体の流れを操作するための制御可能な環境を提供します。結果として得られるラボオンチップデバイスは、サンプル量を大幅に削減し、マルチプレックス機能を備え、分子の時空間制御に独自の可能性を提供します14。パルス噴射15、ダブルエマルジョンテンプレート16、一過性膜排出17、液滴エマルジョン転写18、および流体力学的焦点化19を含む、リポソームを作製するための多数のマイクロ流体法が開発されている。これらの技術は、高いカプセル化効率と高いスループットを備えた単分散の単層細胞サイズのリポソームを生成します。

この記事では、流体力学的ピンチオフとそれに続く溶媒デウェッティングメカニズム20に基づくオンチップマイクロ流体法であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の手順について詳しく説明します(図1)。OLAの働きを泡を吹くプロセスに関連付けることができます。6方向ジャンクションは、内水(IA)相、2つの脂質担持有機(LO)ストリーム、および2つの界面活性剤含有外水性(OA)ストリームを1つのスポットに集中させます。これにより、水中水(脂質+オクタノール)の二重エマルジョン液滴が得られます。これらの液滴が下流に流れると、界面エネルギーの最小化、外部せん断流、およびチャネル壁との相互作用により、溶媒ポケットが剥離するにつれて界面に脂質二重層が形成され、単層リポソームが形成されます。オクタノールポケットのサイズに応じて、デウェッティングプロセスには数十秒から数分かかる場合があります。出口チャネルの終わりには、密度の低いオクタノール液滴が表面に浮遊しますが、より重いリポソーム(より高密度のカプセル化溶液による)は、実験の準備ができた視覚化チャンバーの底に沈みます。代表的な実験として、リポソーム内部の液-液相分離(LLPS)のプロセスが実証されています。そのためには、必要な成分がLLPSを防ぐ酸性pHでリポソーム内に封入されています。pH変化、したがって膜貫通プロトンフラックスを外部から引き起こすことによって、相分離凝縮液滴がリポソーム内部に形成される。これは、OLAシステムの効果的なカプセル化および操作機能を浮き彫りにします。

Protocol

1. マスターウェーハの作製 直径4インチ(10 cm)のクリーンシリコンウェーハを用意します( 材料の表を参照)。加圧空気を使用してさらに清掃し、ほこりの粒子を取り除きます。 ウェーハをスピンコーターにマウントし、ウェーハの中央に~5 mLのネガフォトレジスト( 材料表を参照)を静かに分注します。気泡はウェーハの下流の印刷プロセス?…

Representative Results

本研究では、代表的な実験として、リポソーム内の液-液相分離(LLPS)プロセス を介した 膜のない凝縮物の形成を実証しています。 サンプル調製IA、OA、ES、およびフィード溶液(FS)は、次のように調製されます。 IA: 12% グリセロール、5 mM デキストラン、150 mM KCl、5 mg/mL ポリ L-リジン (PLL)、0.05 mg/mL ポリ-L-リジン-FITC標識 (PLL-FITC)、8…

Discussion

細胞の複雑さは、全体として研究した場合、生細胞を理解することを非常に困難にします。in vitroで主要成分を再構成することによって細胞の冗長性と相互接続性を減らすことは、生物学的システムの理解を深め、バイオテクノロジーアプリケーションのための人工細胞模倣物を作成するために必要です22,23,24。リポソー?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ドルフ・ヴァイヤーズ、ヴェラ・ゴレロワ、マーク・ルーシェンがYFPを提供してくれたことに感謝します。S.D.は、オランダ研究評議会からの財政的支援を認めています(助成金番号:OCENW。クライン.465)。

Materials

1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

参考文献

  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
  8. Zhang, H., D’Souza, G. G. M. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. , 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. 高等生物学. 5 (3), 2000188 (2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -. X., Niederholtmeyer, H., Karim, A. S., Jewett, M. C. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. , 237-255 (2022).

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記事を引用
Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

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