本プロトコルでは、 ネッタイシマカ の一般的な生活パラメータデータ(繁殖力、翅の大きさ、繁殖力、性比、生存率、発育時間、男性の寄与度、成体の寿命など)を測定する方法を説明しています。これらの測定値は、トランスジェニック蚊の適応度を評価するために使用できます。
トランスジェニック蚊は、野生型の蚊と比較して、しばしば適応度を示します。この点で、フィットネスコスト研究では、遺伝子組み換え蚊から生命パラメータデータを収集し、それらを同じ遺伝的背景からの導入遺伝子を欠く蚊と比較することが含まれます。この原稿は、ネ ッタイシマカの一般的な生活史形質(繁殖力、翼のサイズと形状、繁殖力、性比、生存率、発育時間、男性の寄与、成虫の寿命など)を測定する方法を示しています。これらのパラメータは、生殖の成功を反映し、測定が容易で、文献で一般的に報告されているために選択されました。代表的な結果は、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子駆動要素の単一挿入のいずれかに関連する適応コストを定量化します。生命パラメータデータの収集方法を標準化することは重要です。なぜなら、このようなデータは、研究間で生成されたトランスジェニック蚊の健康状態を比較したり、シミュレートされた野生型蚊の集団における導入遺伝子固定率をモデル化したりするために使用できるからです。このプロトコルはトランスジェニック ネッタイシマカに特異的ですが、このプロトコルは他の蚊の種や他の実験的治療条件にも使用できますが、特定の生物学的状況では特別な適応が必要になる可能性があることに注意してください。
適者生存とは、ダーウィンの考えで、自分の環境に最も適した遺伝子を持つ個人は、その遺伝子を次の世代に受け継ぐというものです1。これは、彼らの遺伝子が生き残るかどうかを決定するのはフィットネスであることを意味します。この150年以上の歴史を持つ概念は、おそらく、遺伝子組み換え蚊の遺伝子ドライブを成功させるための最も重要な決定要因です。遺伝子ドライブ、または利己的な遺伝的要素の超メンデル遺伝パターンは、それが集団2を通じて広がるのを可能にし、遺伝的害虫管理3のために探求されています。ベクターコントロールの文脈では、この戦略は、野生型(WT)の節足動物を病原体に耐性のある節足動物に置き換える(集団改変)か、それらをすべて一斉に排除する(集団抑制)かのいずれかを目指しています4。しかし、トランスジェニック蚊は、WT蚊と比較して適応度コスト(遺伝的負荷とも呼ばれる)を示すことが多く、これは、トランスジェニック蚊が彼らを凌駕できる集団で失われることを意味します。したがって、導入遺伝子を遺伝子ドライブシステムと結合させることは、適応度コストを相殺し、導入遺伝子を典型的なメンデル遺伝から予想されるよりも高いレベルで集団全体に押し出すために必要です4。
蚊媒介生物種全体の実験室研究は、導入遺伝子がしばしば適応度を示すことを示しています5,6,7。たとえば、Irvin et al. Drosophila actin 5Cまたは合成3XP3プロモーターの下で増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)またはトランスポゼース遺伝子を発現するように操作されたネッタイシマカ(ae.)の様々な生命パラメータを測定し、それらを野生型のオーランド株(それらが由来したのと同じ遺伝的背景)と比較した5。最も注目すべきは、すべてのトランスジェニック株が生殖適性を有意に低下させたことです5。導入遺伝子に依存して、マラリア原虫の発達を阻害する導入遺伝子を発現する一部のハマダラカ(An.)蚊も適応度コストを示しました6。具体的には、構成的または血粉誘導性プロモーターの下でハチ毒ホスホリパーゼ(PLA2)を発現するAn. stephensiは、対照と比較して産卵数が有意に少なかった6。また、これらの著者らは、異なる導入遺伝子であるSM1ドデカペプチド四量体を発現するトランスジェニックハマダラカが適応度コストを示さなかったことを発見し、導入遺伝子による適応コストは、少なくとも部分的には産生されるトランスジェニックタンパク質の効果に依存していると結論付けた6。実際、適応度コストは、実験室で飼育された系統における導入遺伝子産物、位置効果、オフターゲット効果、挿入突然変異誘発、または近親交配効果に起因する可能性がある7。したがって、遺伝子ドライブは、これらの導入遺伝子による適応コストを相殺するのに十分な堅牢性を備えている必要があり、同時にドライブ自体をブロックする挿入や欠失(インデル)の発生も回避する必要があります。
発達または生殖フィットネスのコストは、実験室またはケージの研究7で測定できますが、フィールドの未知の要因も影響を与える可能性があるという注意点があります。それにもかかわらず、遺伝子ドライブプログラムなどの遺伝子組み換え蚊の放流を計画または評価する際の重要な最初のステップであり、トランスジェニック系統が次の世代にわたって持続するかどうかを判断します。例えば、Hammond et al. 評価 ガンビアのCRISPR/Cas9ベースの遺伝子ドライブは、女性の生殖能力に必要な遺伝子を破壊することを意図しています8。著者たちは、少なくとも25世代にわたって維持されたケージの研究を通じて、蚊がCRISPRを標的とした切断をブロックし、女性の生殖能力を回復させる遺伝子駆動抵抗性対立遺伝子を引き起こしたことを発見しました8。彼らのモデリング努力は、遺伝子ドライブに対してヘテロ接合体である女性の生殖能力が、シミュレートされた条件での遺伝子ドライブの固定に最も劇的な影響を与えたことを示唆しました8。これと同じ方針で、Ae. aegypti(ヒッグス白眼科、HWE)は、異なるプロモーターまたは異なる遺伝子間遺伝子座で自律的な遺伝子ドライブカセットを発現するように操作され、シミュレートされた集団で異なる遺伝子ドライブ固定率を示しました9。著者らは、MGDrivEモデリング10を用いて、測定されたインデル形成率、母体への影響、および実験室で収集された生命パラメータデータを組み合わせて、シミュレートされた条件9において、蚊の適応度が遺伝子ドライブの持続性に最も強く影響することを発見した。遺伝子ドライブ効率を損なう可能性が最も高い適応度コストは、内因性ドライブ自体ではなく、体細胞Cas9(過剰)発現または特にヘテロ接合体において標的とされる遺伝子に起因する11,12,13,14,15,16,17。
その重要性を考えると、適応度はトランスジェニック系統がその後の世代にわたって持続する能力にとって重要な要素であり、導入遺伝子に関連するあらゆる生理学的効果の指標として使用することができます。例えば、オフターゲット効果は、フィットネスコストと関連している可能性がある。この場合、トランスジェニック系統を数世代にわたって戻し交配することが推奨される。さらに、トランスジェニック集団が現実世界でどの程度競争できるかを調査するために、トランスジェニックラインをフィールド集団を反映するラインと交差させることも必要になる場合があります。適応度コストを定量化して比較できるようにするために、この原稿では、Ae. aegypti蚊の一般的な生活史形質を測定するための簡単なプロトコルを提供し、特に導入遺伝子に関連する適応度コストに重点を置いて、そのような研究をより簡単に再現できるようにしています。プロトコルには、繁殖力、生殖能力、性比、生存率、発育時間、男性の貢献、および成人の長寿が含まれます。翼の長さと面積の測定は、胸部の長さ18,19および体の大きさの測定値と相関するため、フィットネス測定値としても選択されました。これは、血液ミールのサイズ、繁殖力、および免疫力20,21に直接関連しています。フィットネスを評価する方法はたくさんありますが、これらのパラメーターが選択されたのは、生殖の成功を反映しており、測定が簡単で、文献で一般的に報告されているためです。
Ae. aegyptiの適応度研究は、この原稿で述べられているように、トランスジェニックカーゴ(遺伝子駆動要素など)または遺伝子ノックアウトに関連する適応度コストを評価するために、実験室でよく行われます。しかし、これらの研究は、ボルバキアに感染した30,31、殺虫剤耐性の32,33、アルボウイルスに?…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、このプロトコルのサポートについて、ミズーリ大学のBill Reid博士とAlexander Franz博士に感謝します。また、著者らは、R解析を支援してくださったNIH/NIAIDのBenjamin Krajacich博士にも感謝します。この研究は、NIH、助成金番号R01 AI130085(KEO)、およびNIH / NIAIDの学内研究プログラムAI001246(EC)部門によって資金提供されました。
1 oz. translucent plastic souffle cups | WebstaurantStore | 301100PC | |
2 oz. translucent polystyrene souffle cups | WebstaurantStore | 760P200N | |
3 mL plastic pipettors | Cornin | 357524 | |
50 mL conical tubes | Any brand | ||
64 oz. white double poly-coated paper food cup | WebstaurantStore | 999SOUP64WB | for mosquito enclosement |
65 mm lens | Canon | MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo | Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient |
Aedes aegypti mosquitoes | BEI | multiple strains as eggs are available | |
Artifical membrane feeders | https://lillieglassblowers.com/ | Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm | Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm? |
ATP | MP Biomedical | ICN15026605 | Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20 |
Autoclave | for sterilizing water for hatching | ||
Canon EOS 7D camera | Canon | 3814B004 | for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient |
defibrinated sheep blood | Colorado Serum Co. | 60 ml, every 2 weeks | https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated |
Dual Gooseneck Microscope Illuminator | Dolan Jenner Fiber-Lite 180 | 181-1 System | |
Ethanol | |||
Forceps | Dumont | 5SF | |
Gauze | omnisorb ii | 4" non-woven sponges | |
glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm | VWR | 75845-546 | for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice |
Hogs' gut | Any Deli | we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical | |
Ice | |||
Ice bucket | |||
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
Leica GZ4 StereoZoom microscope | for screening transgenic mosquitoes (if applicable) | ||
Paintbrush | AIT synthetic brush | size 10-0 | for manipulating larvae/pupae (Amazon) |
Panty hose | Walmart | L'eggs Everyday | Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton) |
Pencils | Any brand | ||
Plastic containers for 2° storage of cartons | Walmart | Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8 | |
Plastic containers for growing larvae | Walmart | Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10 | |
Plastic containers for hatching larvae | Walmart | Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White | |
polypropylene clear deli containers | WebstaurantStore | 127DM12BULK | 12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK) |
Rubber bands | Office Max | #100736/#909606 /#3777415 | 12", #64 and #10 |
Rubber stopper | VWR | 217-0515 | for mosquito enclosement |
Sugar source, such as sugar cubes or raisins | |||
Tetramin flake food | Tetramin | 16106 | |
tpsDig | Stony Brook Morphometrics | A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/ | |
tpsUtil | Stony Brook Morphometrics | A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/ | |
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Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper | Whitman | 1001-824 | for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs. |