マウス関節炎組織からの初代滑膜マクロファージおよび線維芽細胞の単離と培養
概要
本研究は、マウス炎症性関節炎組織から滑膜マクロファージおよび線維芽細胞を単離するための修正されたプロトコルを提供する。
Abstract
関節リウマチは、関節の慢性炎症を引き起こす自己免疫疾患です。滑膜マクロファージと滑膜線維芽細胞は、関節リウマチの病因において中心的な役割を果たしています。炎症性関節炎の病理学的進行と寛解の根底にあるメカニズムを明らかにするために、両方の細胞集団の機能を理解することが重要です。一般に、インビ トロ 実験条件は、 可能な限りインビボ 環境を模倣すべきである。初代組織由来細胞は、関節炎における滑膜線維芽細胞を特徴付ける実験に使用されています。これに対し、炎症性関節炎におけるマクロファージの生物学的機能を調べる実験では、細胞株、骨髄由来マクロファージ、血中単球由来マクロファージが用いられてきた。しかし、このようなマクロファージが実際に組織常在性マクロファージの機能を反映しているかどうかは不明である。常在性マクロファージを得るために、以前のプロトコルは、炎症性関節炎マウスモデルにおいて滑膜組織から一次マクロファージおよび線維芽細胞の両方を単離および増殖するように改変された。これらの初代滑膜細胞は、炎症性関節炎の インビトロ 分析に有用であり得る。
Introduction
関節リウマチ(RA)は、滑膜の過形成を特徴とする自己免疫疾患であり、関節破壊につながります1,2。組織に常在するマクロファージと線維芽細胞は、関節の恒常性を維持するために健康な滑膜に存在します。RA患者では、滑膜線維芽細胞(SF)が増殖し、単球を含む免疫細胞が滑膜および関節液に浸潤し、炎症に関連するプロセスである1,3,4。常在マクロファージや末梢血単球由来マクロファージを含む滑膜マクロファージ(SM)やSFは異常に活性化され、RAの病態形成に重要な役割を果たしています。最近の研究では、SMとSFの間の細胞間相互作用がRAの増悪と寛解の両方に寄与することが示唆されています5,6。
RAの病因を理解するために、K / BxN血清転移関節炎、コラーゲン誘発性関節炎、コラーゲン抗体誘発性関節炎など、炎症性関節炎のいくつかのげっ歯類モデルが使用されています。細胞ベースのアッセイは、関節炎の分子機能を明らかにするために一般的に必要とされています。したがって、関節炎の動物モデルから初代細胞が単離されている。マウス関節炎組織からSFを単離する方法は十分に確立されており、これらの細胞は関節炎の発症機序の分子メカニズムの解明に貢献しています7,8。一方、骨髄由来マクロファージ、血中単球由来マクロファージ、およびマクロファージ細胞株は、関節炎研究のためのマクロファージリソースとしてしばしば使用されている9,10。マクロファージは微小環境に関連する機能を獲得できるため、マクロファージの一般的な供給源は関節炎組織に特異的な応答を欠いている可能性があります。また、マウス滑膜は関節炎モデルにおいても非常に小さな組織であるため、ソーティングによって十分な滑膜細胞を得ることは困難である。インビトロ研究のための滑膜マクロファージの使用の欠如は、関節炎研究における制限であった。滑膜マクロファージを分離・増殖させるプロトコールの確立は、関節リウマチの病態メカニズム解明に有利である。
SFを分離する以前の方法では、SMは破棄されました7。それに加えて、いくつかの臓器から常在マクロファージを分離および増殖させる方法が報告されました11。したがって、既存のプロトコルは組み合わせて変更されました。この改変は、SMとSFの両方の一次培養を高純度で達成することを目的としています。この方法の全体的な目標は、マウス関節炎組織からSMとSFの両方を分離および拡張することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで開発されたこの方法は、マウス関節炎からのSFと多数の臓器からの常在マクロファージの両方を単離するための以前の技術を改良したものです7,11。改変法は、炎症性滑膜からマクロファージと線維芽細胞の両方を高純度で単離することができ、簡便で再現性があります。セルソーターなどの複雑な器具を必要としないため、誰でも実施でき?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、愛媛大学先端研究支援センター(ADRES)医学研究支援部門と、愛媛大学プロテオサイエンスセンター統合病態学部門の方々の技術支援と有益なサポートに感謝しています。本研究の一部は、日本学術振興会(JSPS)科研費JP17K17929、JP19K16015、JP21K05974(NSへ)およびJP23689066、JP15H04961、JP15K15552、JP17K19728、JP19H03786(YIへ)の助成を受けて行われました。大阪難病医学研究財団、中富財団、日本骨ミネラル学会ライジングスター助成、住友財団、千信医学研究財団、持田記念財団(NSへ)武田科学振興財団医学研究助成、UCBジャパン(UCBJ)プロジェクト助成、JSBMRフロンティアサイエンティスト助成2019(YIへ)。
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
参考文献
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
