概要

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

Published: July 28, 2023
doi:

概要

コロニー形成単位(CFU)の測定は、目に見えるコロニーを形成するのに数週間かかる結 核菌 を含む細菌を定量するためのゴールドスタンダード技術です。ここでは、時間効率の向上、ラボのスペースと試薬コストの削減、ミディアムおよびハイスループット実験へのスケーラビリティを備えたCFU測定用のマイクロCFUについて説明します。

Abstract

感染性病原体による世界の死因の第1位である結核(TB)は、2022年に160万人が死亡しましたが、2019年から2021年のパンデミック時にCOVID-19によってのみ上回りました。この病気は、 結核菌 (M.tb)によって引き起こされます。唯一の結核ワクチンである マイコバクテリウム・ウシ・バ チルス・カルメット・ゲラン(BCG)は、世界最古の認可済みワクチンであり、現在も使用されています。現在、12種類のワクチンが臨床試験中であり、数十種類のワクチンが前臨床開発中です。前臨床試験で結核ワクチンの有効性を評価するために使用される方法は、コロニー形成ユニット(CFU)アッセイによる細菌コロニーの列挙です。この時間のかかるアッセイは、結論が出るまでに4〜6週間かかり、ラボとインキュベーターのスペースがかなり必要で、試薬コストが高く、汚染されやすいです。ここでは、 M.tb ワクチンの有効性結果を分析するためのシンプルで迅速なソリューションを提供する、コロニーの計数に最適化された方法であるmicro-CFU(mCFU)について説明します。mCFUアッセイは、必要な試薬を10倍に減らし、インキュベーション期間を3倍に短縮し、結論までに1〜2週間かかり、ラボのスペースと試薬コストを削減し、多数の M.tbを扱うことに関連する健康と安全のリスクを最小限に抑えます。さらに、結核ワクチンの有効性を評価するために、マイコバクテリアに感染したワクチン接種動物の組織など、さまざまなソースからサンプルを採取することができます。また、感染研究のために単細胞で均一で高品質のマイコバクテリア培養物を製造するための最適化された方法についても説明します。最後に、これらの手法をワクチンの有効性判定の前臨床試験に普遍的に採用し、最終的に結核ワクチン開発の時間を短縮することを提案します。

Introduction

結核(TB)は、単一の感染性病原体である 結核菌 (M.tb)による世界の主要な死因であり、他のどの病原体よりも多くの死者を出しています。2021年、結核は160万人の死亡者を出し、2019年から2021年のパンデミック1ではCOVID-19に抜かれました。さらに、世界保健機関(WHO)の2022年のグローバル結核報告書によると、COVID-19のパンデミックが新規結核患者の増加の原因となっています。また、WHOは、この期間に結核と診断された人の数が大幅に減少したと報告しており、結核の症例数がさらに増加する可能性があります1

カルメット・ゲラン菌(BCG)は、100年以上前に初めてワクチンとして使用された病原性マイコバクテリウム・ウシの弱毒生株です。これは結核に対する唯一のワクチンであり、現在も使用されている世界最古の認可ワクチンです2,3。現在、臨床試験の異なる段階にある12のワクチン4があり、数十のワクチンが前臨床開発中である5,6結核ワクチンの前臨床評価には、ゼブラフィッシュ、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒト以外の霊長類などの多様な動物モデルで得られる安全性と免疫原性の評価7が含まれる8,9,10。さらに、M.tb感染および/または伝播に対する防御を誘導するワクチンの能力、すなわちワクチンの有効性を評価するには、in vivoでのM.tbチャレンジが必要です5,11。興味深いことに、BCGワクチン接種は、訓練された免疫のメカニズムを通じて、他の細菌およびウイルス病原体の生存に影響を与える非特異的効果を誘発します12,13。感染した動物の生存可能な細菌負荷を定量化するために選択する方法は、コロニー形成単位(CFU)アッセイ5,15による細菌コロニーの列挙です。CFUは、特定の増殖条件下でコロニーを形成する微生物(細菌または真菌)の数を推定する単位です。CFUは生存可能な複製微生物に由来し、各コロニー内の生きた微生物の絶対数を推定することは困難です。コロニーが1つ以上の微生物に由来するかどうかは不明です。CFU単位はこの不確実性を反映しているため、同じサンプルの繰り返しで大きなばらつきが観察されます。この時間のかかるアッセイは、バイオセーフティレベル3(BSL3)施設、十分な実験室とインキュベータースペースで働くように訓練された専門技術者を必要とし、結論が出るまでに4〜6週間かかり、汚染されやすいです。

この研究では、コロニーの計数に最適化された方法であるマイクロCFU(mCFU)について説明し、結果を分析するためのシンプルで迅速なソリューションを提供します151617181920。mCFUアッセイは、必要な試薬を10倍に減らし、インキュベーション期間を3倍に短縮し、結論までに1〜2週間かかり、ラボのスペースと試薬コストを削減し、多数のM.tbを扱うことに関連する健康と安全のリスクを最小限に抑えます。私たちは、この方法をワクチンの有効性判定の前臨床試験に広く採用し、最終的に結核ワクチンの開発期間を短縮することを提案します。最後に、この最適化されたCFU計数法は、マイコバクテリアだけでなく、大腸菌Ralstonia solanacearumなどの他の細菌の定量にも使用されています21

Protocol

注:ここで説明するプロトコルはBCG用ですが、あらゆるマイコバクテリアに適用できます。BCGは、BSL3施設が利用できない場合に結核実験の代理細菌として使用することができます22。BCGを使用した以下の手順は、バイオセーフティレベル2(BSL2)の実験室で実行し、危険群2の微生物を操作するための適切なバイオセーフティガイドラインと適切な実験室慣行に従う必要がありま?…

Representative Results

ここで説明するmCFUアッセイは、1つのペトリ皿から取り出すことができる情報量を少なくとも96倍に増やします。図5は、結核治療のための宿主特異的薬剤としてのサキナビル(SQV)31,32の再利用における2つの薬物送達方法の比較を示している。このアッセイでは、結核菌の4つの異なる株を使用して、初代ヒトマクロファー…

Discussion

結核は重要な公衆衛生上の問題であり、特に低・中所得国において重要性が高まっています。新型コロナウイルス感染症(COVID-19)のパンデミック(世界的大流行)において、結核の診断と治療のための医療現場が混乱したことで、新規症例の発生率に悪影響を及ぼしました1。さらに、この流行を制御するために、多剤耐性および広範囲の薬剤耐性M.tb株、およびM.tb?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ポルトガル・カトリカ大学医学部の内部資金と、UIDP/04279/2020、UIDB/04279/2020、およびEXPL/SAU-INF/0742/2021の助成金に基づくFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT)からの外部資金によって支援されました。

Materials

96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 – 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

参考文献

  1. World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. 免疫学. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).

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記事を引用
Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).

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