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概要

イメージングプラットフォーム「The Lifespan Machine」は、大規模な個体群の生涯にわたる観察を自動化します。寿命、耐ストレス性、病因、および行動老化アッセイを実行するために必要な手順を示します。データの質と範囲により、研究者は生物学的および環境的変動が存在するにもかかわらず、老化への介入を研究することができます。

Abstract

一定の環境で飼育された遺伝的に同一の動物は、寿命の広い分布を示し、研究対象のすべての生物にわたって保存された老化に対する大きな非遺伝的、確率的側面を反映しています。この確率的要素は、老化を理解し、寿命を延ばしたり健康を改善したりする成功した介入を特定するために、研究者は実験動物の大規模な集団を同時に監視する必要があることを意味します。従来の手作業による死亡スコアリングでは、大規模な仮説検証に必要なスループットとスケールが制限されるため、ハイスループットの寿命アッセイのための自動化されたメソッドが開発されています。Lifespan Machine(LSM)は、線虫の生涯にわたる追跡のために、改造されたフラットベッドスキャナーとカスタム画像処理およびデータ検証ソフトウェアを組み合わせたハイスループットイメージングプラットフォームです。このプラットフォームは、大規模な動物集団から、前例のない規模で、経験豊富な研究者が手動で行うアッセイと同等の統計的精度と精度で、高度に時間分解された寿命データを生成することにより、大きな技術的進歩を構成します。最近では、加齢に伴う行動や形態の変化を定量化し、寿命に結びつけるためにLSMがさらに発展しています。ここでは、LSMを使用して自動化されたライフスパン実験を計画、実行、および分析する方法について説明します。さらに、行動データの収集と高品質の生存曲線の収集を成功させるために必要な重要なステップを強調します。

Introduction

老化は、生物の生理学的機能の低下を特徴とする複雑で多面的なプロセスであり、時間の経過とともに病気や死亡のリスクが高まります¹。寿命は、出生または成人期の開始から死亡までの時間として測定され、老化の明確な結果² と、集団間の相対的な老化率を測定するための間接的ではあるが厳密に定量的なプロキシ^{を提供します3。}老化研究は、介入に曝露された1つの集団と曝露されていない対照群の間の結果を比較するために、臨床試験と同様に寿命の正確な測定に依存することがよくあります。残念なことに、再現性の問題は老化研究に蔓延しており、統計的に検出力が^{不十分な実験} 4や^、環境の微妙な変化に対する寿命アッセイの固有の感度が原因であることがよくあります5。ロバストな実験には、大規模な母集団の複数回の反復が必要であり、このプロセスは^{、自動化6}によって提供される実験のスケーラビリティから特に恩恵を受けます。

寿命アッセイの厳しい要求は、老化プロセス自体の予測不可能性に起因しています。同一の環境に収容された同質の個体は、異なる死亡時間と生理学的低下率を示し⁷、寿命には高度な^確率性が関与していることを示唆している^7,8。したがって、平均寿命や最大寿命の変化など、老化プロセスの定量的な変化を測定し、個人差から生じるバイアスを克服するには、大規模な集団が必要です。さらに、ハイスループットな寿命アッセイの能力は、生存曲線の形状と老化の動態のモデルの研究をサポートするために重要です⁹。

線虫 Caenorhabditis elegans は、その短い寿命、遺伝的トラクタビリティ、および迅速な生成時間により、老化研究にとって非常に貴重なモデルであり、ハイスループットな老化および寿命アッセイへの適合性を強調しています。伝統的に、 Cの寿命。 エレガンスは 、約50〜100匹の動物の同期した小さな個体群を固体媒体で経時的に追跡し、個々の死亡時刻を書き留めることによって測定されています。動物が年老いて運動能力を失うと、死亡時間を手作業で記録するには、動物を個別に突っ込み、頭や尾の小さな動きをチェックする必要があります。これは通常、退屈で面倒なプロセスですが、それを加速するための努力がなされています^10、11、12。重要なことは、実験パイプラインの遅さは、老化の理解と検証された介入の有効性の進歩を妨げているということです。

定量的データに対する老朽化研究の要求を満たすために、マイクロ流体チャンバーからフラットベッド^{スキャナー13、14、15、16、17、18}まで、データ収集を自動化するための多くの技術が開発されています。LSMは、ユーザーが自動分析を検証、修正、および改良できる広範なソフトウェアスイートと組み合わせた慎重な機器校正プロトコルの開発によって達成される、高精度で正確な寿命データを収集するための広範な最適化において他の方法とは異なります¹³。このソフトウェアは、原理的には多様なイメージングモダリティに適用できますが、実際には、ほとんどのユーザーは、環境の温度と湿度を微調整できるように改造されたフラットベッドスキャナーを使用しています – 寿命に大きな影響を与えるため、非常に重要な要素です¹⁹。LSMは、環境条件や遺伝子型に応じて、数日から数か月の間隔で20分ごとに線虫の画像を撮影します。生成されたデータは、手動アッセイのデータと比較してはるかに高い時間分解能であり、収集された画像は、生涯にわたって線虫の位置の永続的な視覚的記録を提供します。機械学習の手法を用いて、各個人に死の時間が自動的に割り当てられます。これらの結果は、「Worm Browser」と呼ばれるクライアントソフトウェアを使用して、手動で迅速に検証できます。そのハードウェアとソフトウェアの結果として、LSMは、経験豊富な研究者の手による手作業による死亡スコアリングと統計的に区別がつかない生存曲線を生成することができ、作業負荷の減少とスケーラビリティの向上という利点もあります¹³。

また、LSMの最新版では、線虫の生涯にわたる形態学的および行動学的データを収集し、各個体の寿命とともに報告することにより、行動老化の研究も可能になっています。特に、LSMは、個体の「健康寿命」を寿命とは異なるものとして定量化するためによく使用されるランドマークである、各動物の活発な運動停止(VMC)の時間を捉えます。LSMは、寿命と行動の老化データを同時に収集することにより、老化のさまざまな表現型の結果に異なる影響を与える可能性のある介入の研究をサポートします²⁰。肉眼的に観察可能な様々な表現型を用いて、身体運動または咽頭ポンプ²¹、組織の完全性²²、および運動速度または刺激誘発性回転¹⁷などの行動老化を研究することができる。異なる老化表現型間の比較は、老化プロセスの因果構造の分析をサポートすることができます。例えば、VMCと寿命の比較は、最近、線虫の2つの異なる老化プロセスを特徴づけるために用いられた²³。

LSMは当初、線虫の寿命を測定するために開発されましたが、Cを含むさまざまな線虫種からの生存および行動データの収集をサポートしています。ブリッグサエ、C。トロピカリス、C。ジャポニカ、C。brenneri、および P.パシフィカス²³。この技術は、寿命、ストレス耐性、および病原体抵抗性に対する生物学的および環境的介入の効果の研究を容易にし、RNA干渉の標的アッセイやオーキシン誘導性タンパク質分解システムなどの実験ツールと組み合わせることができます。今日まで、それは幅広い用途のために科学文献で使用されてきました6,24,25,26,27,28,29,30。

ここでは、寒天プレートを使用してLifespan Machine実験を行うためのプロトコルを、実験セットアップの初期段階から結果として得られる生存曲線の出力まで、段階的に概説します。LSMの特徴は、作業が高度に前倒しされていることであり、研究者の時間の大部分は実験のセットアップと、ごくわずかながら画像取得後の取得に費やされます。データ収集は実験の全期間にわたって完全に自動化されており、研究者は「ハンズフリー」で体験することができます。ここで説明するステップは、多くの異なるタイプの生存アッセイに共通しており、寿命、耐熱性、酸化ストレス、および病因アッセイに対して同じ実験セットアップが行われます。代表的な結果のセクションでは、最近発表された論文のデータのサブセットについて議論し、分析パイプラインの有効性を説明し、画像分析中の最も重要なステップを強調します²³。

Protocol

1. ソフトウェア要件とハードウェア要件 フラットベッドスキャナー:原則として、LSMはさまざまなイメージングデバイスを使用して実装できます。スキャナーの変更とフォーカシングの詳細な手順は、他の場所で入手できます13.LSM ハードウェアを 補足図 1 に示します。 データ解析ツール:LSMソフトウェアには、Linuxベースのスキャナ?…

Representative Results

ライフスパンアッセイにおける実験の再現性は困難であり、十分な統計的分解能を達成するには、厳密に制御された実験条件と大規模な集団の両方が必要です4,36。LSMは、高い時間分解能で一定の環境で動物の大規模な集団を調査するのに特に適しています。LSMの能力を実証し、分析の重要なステップを強調し、研究者が労働努力に優先順位を付け?…

Discussion

ここでは、最新バージョンのLifespan Machineを使用して実験を実行するための詳細でアクセス可能なプロトコルを提供します。私たちは、十分に分解された生存曲線を達成するための重要なステップは、画像取得後の非線虫オブジェクトを手動で除外することであることを示しました。手作業による死亡時間アノテーションは、生存曲線の全体的な形状にほとんど影響を与えず、手動アノテーシ…

Materials

1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners