概要

エクソソーム含有コラーゲンパッチとオフポンプ冠動脈バイパス移植による慢性心筋虚血の外科的ブタモデル

Published: September 15, 2023
doi:

概要

本研究では、進行性冠動脈狭窄症による慢性心筋虚血の外科的ブタモデルを提示し、梗塞を伴わずに心機能障害を呈する。虚血後、動物は、幹細胞由来のエキソソームを含むコラーゲンパッチの心外膜留置を伴うオフポンプ冠動脈バイパス移植を受けます。この補助療法は、心筋機能と回復を改善します。

Abstract

進行性冠動脈狭窄症による慢性心筋虚血は、代謝活性を低下させることで酸素利用能の低下に適応する心筋として定義される冬眠心筋(HIB)を引き起こし、それによって不可逆的な心筋細胞の損傷や梗塞を防ぎます。これは心筋梗塞とは異なり、HIBは血行再建術で回復する可能性があります。重篤な冠動脈疾患(CAD)の患者は慢性虚血を経験し、心不全や突然死のリスクにさらされます。重症CADに対する標準的な外科的介入は冠動脈バイパス術(CABG)であるが、これは不完全な治療法であることが示されているが、慢性虚血に適応した筋細胞を回復するための補助療法は存在しない。 このギャップに対処するために、CABGに従順で臨床シナリオを模倣したブタを使用したHIBの外科モデルが使用されました。このモデルには2つの手術が含まれます。最初の手術では、左前下行動脈(LAD)に1.5mmの硬い収縮器を埋め込みます。動物が成長するにつれて、収縮筋は徐々に著しい狭窄を引き起こし、局所収縮機能が低下します。狭窄が80%に達すると、心筋の流れと機能が損なわれ、HIBが発生します。次に、左内乳腺動脈(LIMA)でオフポンプCABGを行い、虚血領域を血行再建します。動物は1ヶ月間回復し、犠牲になる前に最適な心筋の改善を可能にします。これにより、さまざまな治療群の生理学的および組織学的研究が可能になります。この動物モデルは、CABGにもかかわらず心機能が損なわれたままであることを示しており、新しい補助的介入の必要性を示唆しています。本研究では、間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームを包埋したコラーゲンパッチを開発し、LIMA吻合の遠位にある心外膜表面に外科的に適用しました。この材料は心外膜に適合し、吸収性であり、シグナル伝達因子の持続的な放出のための足場を提供します。この再生療法は、血行再建術だけでは反応しない心筋の回復を促すことができます。このモデルは、HIBの回復に関する生理学的およびメカニズム的調査の手段を提供することにより、臨床分野に変換されます。

Introduction

世界的に、重度のCADは1億人以上の患者が罹患しており、死亡率は低下していますが、依然として主要な死因の1つです1,2。CADには、心筋梗塞(MI)から生存率が保たれた虚血まで、幅広い臨床スペクトルがあります。ほとんどの前臨床研究は、小動物モデルと大動物モデルで研究できるため、梗塞組織の存在を特徴とする心筋梗塞に焦点を当てています。ただし、そのモデルは、生存率が維持され、血行再建術に適している患者には対応していません。CABGを受けているほとんどの患者は、収縮予備能と生存率の変動を維持しながら、血液供給が減少し、機能が制限されています3。治療を行わないと、これらの患者は、特に作業負荷の増加時に、進行した心不全や突然死に進行する可能性があります4。これらの患者のうち、冠動脈バイパス術(CABG)は有効な治療法ですが、完全な機能回復には至らない可能性があります5。重要なことに、臨床転帰の悪化のマーカーである拡張期機能障害は、血行再建術後に回復せず、CABG 6,7 中の新しい補助療法の必要性を示唆しています。現在、心筋細胞を完全な機能能力に回復させるためにCABGで使用される臨床的に利用可能な補助介入はありません。これは、適切な血行再建術にもかかわらず、多くの患者が進行性心不全に進行することを考えると、大きな治療上のギャップです8。

臨床CADの経験を模倣するために、CABGに従順な慢性心筋虚血の革新的なブタモデルが作成されました9。ブタは心外膜橋の側副を持たないため、他の大型動物よりも心臓病の優れたモデルとなるため、LADの狭窄だけでは局所虚血を引き起こします10。この研究では、生後16週齢の雌のヨークシャーランドレース豚を使用しました。このモデルでは、左内乳腺動脈(LIMA)移植片を使用して、オフポンプCABGでLADを血行再建しました(補足表1)。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、収縮器が硬い装置であるため、狭窄を開くことはできません。心臓磁気共鳴画像法(MRI)は、全体的および地域的な機能、冠状動脈の解剖学的構造、および組織の生存率を評価するために使用されます。心臓MRI分析では、ピーク充填率(PFR)を特徴とする拡張期機能が、CABG6にもかかわらず損なわれたままであることが示されました。拡張期機能障害のメカニズムは、CABG11の後も持続するHIBのミトコンドリア生体エネルギーとコラーゲン形成の障害に関連している可能性があります。

間葉系幹細胞(MSC)は、エキソソームを介して治療シグナル伝達を行い、CABG中に適用した場合に心筋の回復を改善します。このブタモデルと並行した in vitro試験では 、CABG中に心外膜MSCビクリルパッチを配置すると、ミトコンドリアのエネルギー代謝の重要な調節因子である主要なミトコンドリアタンパク質、すなわちPGC-1α12が増加し、収縮機能が回復することが示されました13in vitro モデルにより、ミトコンドリア機能障害に対する間葉系幹細胞のシグナル伝達メカニズムを調べることができました。エクソソームは、マイクロRNA(miRNA)14を含むタンパク質または核酸を含む分泌安定性のあるマイクロベシクル(50-150 nm)です。最近の in vitro データでは、MSC由来のエクソソームがミトコンドリア呼吸の回復に必要な重要なシグナル伝達機構であることが示唆されています。

幹細胞由来のエクソソームは、容易に入手でき、商業的に生産でき、倫理的な対立がないため、有望な補助治療薬です。臨床翻訳を考慮し、MSC由来のエクソソームを包埋したコラーゲンパッチを作製し、心筋の冬眠領域に外科的に縫合できるようにしました。このパッチを用いてエクソソームの持続的な送達が可能であることが実証され、ミトコンドリアの回復を標的とし、ミトコンドリアの生合成を促進するパラクリンシグナル伝達機構を備えた無細胞再生療法が提供されることが実証された15。この手順は、ミトコンドリア機能を強化し、血行再建術時の炎症を軽減し、慢性虚血への筋細胞の適応を逆転させることによって心機能を改善するためのMSC由来の治療法の影響を研究するための前臨床モデルを提供します。

この研究では、CAD患者の標準治療を模倣した近位LAD狭窄の領域をバイパスするために、LIMAからLADへの吻合を使用してオフポンプCABGの外科的方法が示されています。CABGの併用療法として、MSC由来のエクソソーム包埋コラーゲンパッチを心筋虚血領域に外科的に適用することが実証されました。この手術モデルは、エクソソームパッチの使用で見られるパラクリン効果に対する生理学的反応と、回復の分子メカニズムを研究するために使用できます。

Protocol

ミネアポリスVAメディカルセンターとミネソタ大学の動物実験委員会(IACUC)は、すべての動物実験を承認しました。実験動物の使用とケアに関する現在の国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従いました。 1. 間葉系幹細胞の単離とエクソソームの作製と特性評価 骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)の単離生後20週齢の雌のヨークシャーランドレース豚の胸?…

Representative Results

血行再建術後、冠動脈造影を実施して、LAD狭窄症(80%以上)とLIMA-LAD移植片の開存性を評価します(図1)。血行再建術とエクソソーム含有コラーゲンパッチの留置から4週間後、心臓MRIを実施して、安静時およびストレス下での心臓の収縮期および拡張期機能を評価します 5μg/kg/minの低用量ドブタミン注入を使用します。収縮期機能は、壁の厚さのパーセンテージ(収縮末期の?…

Discussion

本研究は、慢性虚血性心筋の初めてのブタモデルを提示し、外科的血行再建術中にMSC由来のエクソソームを含むコラーゲンパッチによる治療が、ミトコンドリアの回復を標的とすることにより、異方性刺激時に拡張期および収縮期機能が回復することを示しました。以前、HIBの大型動物モデルでは、心臓MRIで測定された拡張期および収縮期機能は損なわれたままであり、完全に回復すること?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国(U.S.)のVA Merit Review #I01 BX000760(RFK)の支援を受けました。退役軍人省BLR&Dおよび米国退役軍人省助成金 #I01 BX004146(TAB)。また、ミネソタ大学リレヘイ心臓研究所の支援にも感謝します。この作業の内容は、米国政府の米国退役軍人省の見解を表すものではありません。

Materials

5 Ethibond Ethicon MG46G Suture
# 40 clipper blade Oster 078919-016-701 Remove hair from surgery sites
0 Vicryl Ethicon J208H Suture
1 mL Syringe Medtronic/Covidien 1188100777 Administer injectable agents
1" medical tape Medline MMM15271Z Secure wound dressing and IV catheters
1000mL 0.9% Sodium chloride Baxter 2B1324X IV replacement fluid
12 mL Syringe Medtronic/Covidien 8881512878 Administer injectable agents
18 ga needles BD 305185 Administration of injectable agents
20 ga needles BD 305175 Administration of injectable agents
20 mL Syringe Medtronic/Covidien 8881520657 Administer injectable agents
2-0 Vicryl Ethicon J317H Suture
250 mL 0.9% saline Baxter  UE1322D Replacement IV Fluid
3 mL Syinge Medtronic/Covidien 1180300555 Administer injectable agents
3-0 Vicryl Ethicon VCP824G Suture
36” Pressure monitoring tubing Smith’s Medical MX563 Connect art. Line  to transducer
4.0 mm ID endotracheal tube Medline DYND43040 Establish airway for Hibernation
4-0 Tevdek II Strands Deknatel 7-922 Suture to secure constrictor around LAD
48” Pressure monitoring tubing Smith’s Medical MX564 Connect art. Line  to transducer
500mL 0.9% Sodium chloride Baxter 2B1323Q Drug delivery, Provide mist for Blower Mister
6  mL Syringe Medtronic/Covidien 1180600777 Administer injectable agents
6.0 mm ID endotracheal tube Mallinckrodt 86049 Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6.5 mm ID endotracheal tube Medline DYND43065 Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6” pressure tubing line Smith’s Medical MX560 Collect bone marrow
60 mL Syringe Medtronic/Covidien 8881560125 Administer injectable agents
7.0 mm ID endotracheal tube Medline DYND43070 Establish airway for Revasc,MRI and Termination
7-0 Prolene Ethicon M8702 Suture
Advanced DMEM (1X) ThermoFisher Scientific 12491023
Alcohol Prep pads MedSource MS-17402 Skin disinfectant
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC910024
Anesthesia Machine Drager Fabious Trio maintains general anesthesia
Anesthesia Machine + ventilator DRE Drager- Fabius Tiro DRE0603FT Deliver Oxygen and inhalant to patient
Anesthesia Monitor Phillips  Intellivue MP70 Multiparameter for patient safety
Arterial Line Kit Arrow ASK-04510-HF Femoral catheter for blood pressure monitoring
Artificial Tears Rugby 0536-1086-91 Lubricate eyes to prevent corneal drying
Bair Hugger 3M Model 505 Patient Warming system
Basic pack Medline DYNJP1000 Sterile drapes and table cover
Blood Collection Tubes- green top Fisher Scientific 02-689-7 Collect microsphere blood samples
Blower Mister Kit Medtronic/Covidien 22120 Clears surgical field for vessel anastomosis
BODIPY TR Ceramide ThermoFisher Scientific D7540
Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle Vidacare 9001-VC-005 Collect bone marrow
Bone Wax Medline ETHW31G Hemostasis of cut bone
Bovie Cautery hand piece Covidien E2516 Hemostasis
Bupivicaine Pfizer 00409-1161-01 Local Anesthetic
Buprenorphine 0.3 mg/mL Sigma Aldrich B9275 Pre operative Analgesic for survivial procedures
Cell Scrapers Corning 353085
Cephazolin 1 gr Pfizer 00409-0805-01 Antibiotic
Chest Tube Covidien 8888561043 Evacuates air from chest cavity
Cloroprep Becton Dickenson 260815 Surgical skin prep
Corning bottle-top vacuum Filter System (500mL) Millipore Sigma 430758
CPT tube BD 362753 MSC isolation from bone marrow
Delrin Constrictor U of MN Custom made Creates stenosis of LAD
Dermabond Ethicon DNX12 Skin adhesive
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES ThermoFisher Scientific 12430062
Dobutamine 12.5 mg/mL Pfizer 00409-2344-01 Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection
ECG Pads DRE 1496 Monitor heart rhythm
Exosome-Depleted FBS ThermoFisher Scientific A2720801
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL Fisher Scientific 13-675-20
Femoral and carotid introducer Cordis- J&J 504606P femoral and carotis cannulas
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS ThermoFisher Scientific 16140089
Flo-thru 1.0 Baxter FT-12100 used to anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25 Baxter FT-12125 FT-12125
Flo-thru 1.5 Baxter FT-12150 FT-12150
Flo-thru 2.0 Baxter FT-12200 FT-12200
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Hair Clipper Oster 078566-011-002 Remove hair from surgery sites
Helistat collagen sponge McKesson 570973 1690ZZ Sponge for embedding exosomes
Heparin Pfizer  0409-2720-03 anticoaggulant
Histology Jars Fisher Scientific 316-154 Formalin for tissue samples
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva SH30071.03
Hypafix BSN Medical 4210 Secure wound dressing and IV catheters
Isoflurane Sigma Aldrich CDS019936 General Anesthestic- Inhalant
IV Tubing for Blower Mister Carefusion 42493E Adapts to IV Fluids for Blower/Mister
Jelco 18 ga IV catheter Smiths medical 4054 IV access in Revasc, MRI and Term
Lidocaine 2% Pfizer 00409-4277-01 Local Anesthetic/ antiarrthymic
Ligaclips Ethicon MSC20 Surgical Staples for LIMA takedown
Long blade for laryngoscope DRE 12521 Allows for visualization of trachea for intubation
Meloxicam 5 mg/mL Boehringer Ingelheim 141-219 Post operative Analgesic
Microsphere pump Collect blood samples from femoral introducer
Monopolar Cautery Covidien Valleylab™ FT10 Hemostasis
Nanosight NS 300 Malvern Panalytical MAN0541-03-EN
NTA 3.1.54 software Malvern Panalytical MAN0520-01-EN-00
OPVAC Synergy II Terumo Cardiovascular System 401-230 Heart positioner and Stabilizer
Oxygen Tank E cylinder various various Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter
PBS, pH 7.2 ThermoFisher Scientific 20012050
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture ThermoFisher Scientific 15640055
Pigtail 145 catheter 6 French Boston Scientific 08641-41 Measure LV pressures
Pressure Transducer various Must adapt to anesthesia monitor Monitor direct arterial pressures
Propofol Diprivan 269-29 Induction agent
Roncuronium Mylan 67457-228-05 Neuromuscular blocking agent
SR Buprenorphine 10 mg/mL Abbott Labs NADA 141-434 Post operative Analgesic
Sterile Saline 20 mL Fisher Scientific 20T700220 Flush for IV catheters
Sternal Saw/ Necropsy Saw Thermo Fisher 812822 Used to open chest cavity
Stop Cocks Smith Medical MX5311L 2 to connect to pig tail
Succinylcholine 20 mg/mL Pfizer 00409-6629-02 Neuromuscular blocking agent
Suction  tubing Medline DYND50223
Suction Container Medline DYNDCL03000
Surgery pack with chest retractor various See pack list Femoral cut down and median sternotomy
Surgical Instruments various See pack list Femoral and carotid cutdowns and sternotomy
Surgical Spring Clip Applied Medical A1801 Clamp end of LIMA after takedown
Syringe pump Harvard Delivers IV Dobutamine infusion
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO Millipore Sigma S32703
Telazol 100 mg/mL Fort Dodge 01L60030 Pre operative Sedative
Telpha pad Covidien 2132 Sterile wound dressing
Timer Time collection of blood samples
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher Scientific 4478359
TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE ThermoFisher Scientific TP90076
Triple Antibiotic Ointment Johnson & Johnson 23734 Topical over wound
Vicryl mesh Ethicon VKML Patch for epicardial cell application
Vortex Mix microspheres
Xylazine 100 mg/mL Vedco 468RX Pre operative Sedative/ analgesic

参考文献

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記事を引用
Aggarwal, R., Shao, A., Potel, K. N., Hocum Stone, L., Swingen, C., Wright, C., McFalls, E. O., Butterick, T. A., Kelly, R. F. Surgical Porcine Model of Chronic Myocardial Ischemia Treated by Exosome-laden Collagen Patch and Off-pump Coronary Artery Bypass Graft. J. Vis. Exp. (199), e65553, doi:10.3791/65553 (2023).

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