概要

蛍光イメージングを用いたキメラ抗原受容体を発現するJurkatの迅速 in vitro 細胞毒性評価

Published: October 27, 2023
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概要

単一の腫瘍の抗原を目標とするキメラ抗原の受容器(CAR)を表現するJurkatのセルによって量的な腫瘍の細胞の殺害を評価するプロトコル。このプロトコルは末梢血得られたT細胞の確認の前にCARの蝶番の構造の急速な最適化のためのスクリーニングのプラットホームとして使用することができる。

Abstract

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、腫瘍学の最前線にあります。CARは、ターゲティングドメイン(通常は一本鎖可変フラグメント、scFv)と、それに付随する鎖内リンカー、それに続くヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインで構成されています。鎖内リンカーおよびヒンジドメインの修飾は、CARを介した死滅に有意な影響を与える可能性があります。CARコンストラクトの各部分にはさまざまなオプションがあるため、多数の順列があります。CAR-T細胞の製造は時間と費用のかかるプロセスであり、多くのコンストラクトの作成とテストには多大な時間と材料の投資が必要です。このプロトコルは、Jurkatセル(CAR-J)のヒンジ最適化CARコンストラクトを迅速に評価するためのプラットフォームを記述しています。Jurkat細胞は、レンチウイルスの取り込み量が多い不死化T細胞株であり、効率的なCAR形質導入を可能にします。ここでは、蛍光イメージャーを用いてCAR-Jを迅速に評価し、PBMC由来T細胞の細胞溶解を確認するためのプラットフォームを紹介します。

Introduction

CAR-T細胞療法は、米国国立がん研究所が報告したように、2017年以降にFDAが承認した6つのCAR-T製品から明らかなように、血液悪性腫瘍において大きな有望性を示しています1。固形腫瘍を標的とする臨床試験には、多数のCAR-T細胞があります。新しいCAR標的を設計し、CARコンストラクトを最適化することは、CAR-T細胞の有効性に不可欠です。腫瘍関連抗原(TAA)を正確に標的とし、正常組織における低レベルのTAA発現を回避するには、各アプリケーションに最適なCARコンストラクトを選択することが不可欠です2

CARコンストラクトは、主に5つのコンパートメントで構成されています:(1)腫瘍抗原を標的とする細胞外一本鎖可変フラグメント(scFv)ドメイン;(2)ヒンジドメイン;(3)膜貫通ドメイン;(4)細胞内細胞質T細胞共刺激ドメイン;(5)シグナル伝達ドメイン。これらのドメインのそれぞれを修飾することは、その標的細胞3と係合するCAR-T細胞の精度に影響を及ぼす。したがって、これらのCARコンストラクトの細胞毒性と交差反応性をin vitroで評価することは、in vivo実験に向けて進むための適切なコンストラクトを選択するために重要です。T細胞による細胞溶解を評価する現在の方法には、51Cr放出アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ、生物発光イメージングアッセイ、リアルタイムインピーダンスベースの細胞解析、および細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ4,5が含まれる。ここで説明する蛍光イメージングベースのプラットフォームは、生細胞と死細胞の数を同定し、T細胞による細胞溶解を評価する間接的な方法とは対照的に、T細胞細胞溶解の直接的な定量化です。

これは、MDA-MB-231トリプルネガティブ乳がん(TNBC)細胞に対する上皮成長因子受容体(EGFR)CARを発現するJurkat細胞の細胞毒性を評価するための、最小限の介入で、簡単で費用対効果が高く、迅速でハイスループットな技術であり、EGFR CRISPRはMDA-MB-231細胞をノックアウトします。Jurkat細胞は、不死化ヒトTリンパ球細胞6であり、T細胞の活性化とシグナル伝達のメカニズムの研究に広く用いられている7。さらに、Jurkat細胞は、複数の研究でin vitroCAR試験に使用されています8,9,10,11Jurkat細胞はレンチウイルスによって容易に形質導入され、増殖が持続するため、このシステムはさまざまなEGFR CARコンストラクトのヒンジドメインを最適化するために活用されました。

このアッセイは、さまざまな腫瘍抗原を標的とする複数のCARコンストラクトのスクリーニングに使用でき、複数の接着腫瘍細胞株に対して、さまざまなエフェクターと腫瘍(E:T)の比率で使用できます。さらに、複数の時点を評価し、反復数を変更して、さまざまなCARコンストラクトの中から最適な殺傷を特定することができます。末梢血単核細胞(PBMC)由来のCD3 T細胞を用いて、最良のコンストラクトを確認する必要があります。この方法の開発の背後にある全体的な目標は、CARヒンジ形状をハイスループットで迅速に最適化し、形質導入効率の低さなどの障壁を克服し、PBMC由来のT細胞で確認することです。

Protocol

注:すべての細胞培養作業は、白衣、手袋を着用し、標準的な無菌技術に従って、バイオセーフティキャビネットで行われます。 1. ジュルカト語を表現するCARの生成(CAR-J) Jurkat細胞を購入し、ATCCからE6-1のクローンを作る。T-75フラスコで1 x 106細胞を解凍し、T-75フラスコで培養します。10% FBSを添加したRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地をインキ?…

Representative Results

CAR-J1 の E:T 比は 1:8 から 8:1 の範囲で 72 時間で評価され、TNBC MDA-MB-231 細胞の EGFR を標的としました。Jurkat細胞をポリブレンを含むCARレンチウイルスで形質導入し、ステップ2で説明したようにCAR-J細胞を作製しました。CAR-J1の細胞毒性は、E:T比が高いほど有意に増加し、1:8比で死滅に差はありませんでした(図1)。4:1 E:T で 72 時間にわたって 50% 以上の死滅が観察されまし?…

Discussion

本研究では、Jurkat細胞におけるCAR発現によって誘導される標的特異的な細胞溶解活性を効率的に評価するための迅速な方法を提案しました。すべてのCARコンストラクトは、同じscFvを持っていますが、ヒンジドメインと膜貫通ドメインが異なり、CAR-T細胞の効力に影響を与えることが示されています13。これらのCAR-Jによる非特異的死滅のさらなる評価は、抗原ノックアウト(KO…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MDA-MB-231は、シェーン・ステックライン博士からの親切な贈り物でした。著者らは、この研究を実施するためにカンザス大学がんセンターから資金提供を受けていることを認めている。

Materials

15 mL Conical Tube (Sterile) Midwest Scientific #C15B Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile) Thermo Scientific 339652 Any similar will work
Black/Clear 96 well plate Falcon 353219 Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter Nexcelcom Bioscience 200-BFFL-5C Any similar will work
Celigo Software Nexcelcom Bioscience Version 5.3.0.0 Any similar will work
Cell Culture Incubator Thermo Scientific HeraCell 160i Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) TPP 90076 Any similar will work
CFSE Tonbo 13-0850-U500 Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer Cytek 0500-3115 Any similar will work
DMEM Gibco 11995-040 Any similar will work
FBS Gemini bio-products 900-108 Any similar will work
Flow Cytometer Cytek, BD, etc Aurora, LSR II, etc Any similar will work
FlowJo Sortware Becton Dickinson & Company  Version 10.7.1 Any similar will work
Fluorobrite DMEM Gibco A18967-01 Any similar will work
GraphPad Software GraphPad Version 9.3.1 (471) Any similar will work
Multichanel Pipette Thermo Scientific Finnpipette F2 Any similar will work
PBS Gibco 10010-031 Any similar will work
PenStrep Gibco 15070-063 Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) Pr1ma PR-1250RK-FL, etc Any similar will work
Pipettors  Thermo Scientific Finnpipette F2 Any similar will work
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP Any similar will work
RPMI Corning 10-041-cv Any similar will work
Serological Pipette Aid Drummond Scientific 4-000-105 Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes) Pr1ma PR-SERO-25, etc Any similar will work
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI Any similar will work
Sterile Reservoirs Midwest Scientific RESE-2000 Any similar will work
Table top centrifuge Eppendorf 5810R Any similar will work

参考文献

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記事を引用
Subham, S., Jeppson, J. D., Gibbs, B. K., Babai, J., Alker, R., Godwin, A. K., Akhavan, D. Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging. J. Vis. Exp. (200), e65560, doi:10.3791/65560 (2023).

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