マウス精巣上体脂肪組織からの間葉系幹細胞の単離、In vitro拡大、および特性評価
概要
脂肪組織は、間葉系幹細胞の優れた供給源です。ここでは、スイスのマウス精巣上体脂肪組織からの脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の段階的な抽出、培養、および特性評価をもたらします。
Abstract
間葉系幹細胞(MSC)は、免疫応答を調節する可能性があるため、主に炎症の悪化を止めるための新しい治療アプローチとして広く研究されてきました。MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の低発現に基づく免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存し、同種移植のための細胞ベースの治療の使用において生存できる免疫特権細胞です。これらの細胞はいくつかの組織から単離することができ、最も一般的に使用されるのは骨髄および脂肪組織です。私たちは、マウスの精巣上体脂肪組織からMSCを分離、培養、および特性評価するための簡単なプロトコルを提供します。精巣上体脂肪組織を外科的に切除し、物理的に断片化し、0.15%コラゲナーゼII型溶液で消化します。次に、初代脂肪組織由来幹(ADSC)細胞を in vitroで培養および増殖させ、フローサイトメトリーによって表現型の特性評価を行います。また、ADSCを骨形成細胞、脂肪形成細胞、軟骨形成細胞に分化するための手順と、それに続く各細胞系統の機能的特性評価についても説明します。ここで提供されるプロトコルは、 in vivo および ex vivo 実験に使用でき、代替として、脂肪由来幹細胞を使用してMSC様不死化細胞を生成することができます。
Introduction
間葉系幹細胞(MSC)は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞1,2などの細胞に分化する成体の多電位細胞です。これらの細胞はいくつかの臓器に存在し、そのため、骨髄、筋肉、脂肪、毛包、歯根、胎盤、真皮、軟骨膜、臍帯、肺、肝臓、脾臓などの成体組織から抽出することができます3,4。
MSCが生理機能と免疫系に及ぼす影響が報告されています5,6。これらの細胞は、ヒト医学と獣医学の両方で、いくつかの疾患の治療に有望です。MSCは、細胞間接触、可溶性因子、および小さな細胞外小胞7,8,9,10などのさまざまなメカニズムを通じて、炎症を制御し、血管新生および組織の恒常性を促進することができる。さらに、MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の発現が低く、同種移植の細胞ベースの治療に使用されるため、免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存できる免疫特権細胞です11,12。低免疫原性と再生能が組み合わさったMSCは、移植片対宿主病(GvHD)13、全身性エリテマトーデス(SLE)14、多発性硬化症15などの細胞治療に理想的な候補となっています16,17。
MSCはいくつかの成体組織に存在するという事実にもかかわらず、脂肪組織は、最小限の外科的介入で、収穫のためのアクセシビリティなど、他の供給源よりも優れています。高い拡張率で利用可能な多数のセル。また、特定の機器や低コストの材料を必要とせずに、簡単に実行できるプロトコルを使用して、in vitroでの展開が容易になります18,19,20。抽出された脂肪組織由来幹細胞(ADSC)は、国際細胞療法学会(ISCT)21によって確立されたように特徴付けられなければならない。したがって、MSCは、形態が線維芽細胞様で、可塑性培養に付着し、エンドグリン(CD105)、ecto-5′-ヌクレオチダーゼ(CD73)、Thy-1(CD90)などの間葉系マーカーを高い割合(≥95%)で発現し、白血球共通抗原(CD45)、膜貫通リン糖タンパク質(CD34)、糖脂質固定膜糖タンパク質(CD14)、インテグリンα M(CD11b)、B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖(CD79α)などの造血マーカーの割合が低い(≤2%)を示さなければなりません。Bリンパ球表面抗原B4(CD19)およびクラスIIヒト白血球抗原(HLA-II)。さらに、機能的な特性評価が必要であり、細胞は骨芽細胞、軟骨芽細胞、または脂肪芽細胞に分化できるべきである21。
ここでは、 in vitro 研究のための機械的解離と酵素消化、およびISCTによって予め設定された形態学的特性評価を使用して、精巣上体脂肪組織からMSCを取得する方法を示します。
Protocol
すべての動物実験は、動物倫理に関する国際的なガイドラインに従って実施され、サンタクルーズ州立大学の機関のケアおよび使用委員会によってプロトコル番号021/22で承認されました。スイスの雄マウス(6〜8週間)は、サンタクルス州立大学動物研究施設(LaBIO-UESC)の動物研究施設から入手し、特定の病原体のない条件で維持され、12時間の明暗サイクルで水と食物を自由に受け取りました。<…
Representative Results
ここに提示されたプロトコルに従って脂肪組織から抽出された細胞は、ISCTによって提案されたMSCの最小基準に一致する形態を示しました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。表現型的には、ADSCは細胞培養の最初の数日間に可塑性および線維芽細胞様形態への付着を示しました(図2A)。さらに、それらは均質に成長し、コロニーを形成しました。…
Discussion
MSCは、さまざまな組織から抽出できます。骨髄はマウスとヒトの両方でMSCの一般的な供給源であるにもかかわらず25,26、この研究では、MSCが豊富であること、体内での分布、およびアクセスの容易さから、脂肪組織を扱うことを選択しました。代替として、脂肪由来幹細胞を使用して、MSC様の不死化細胞27を生成することができる?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) と Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11) の助成金による研究。この研究は、PROPP UESC(073.6764.2019.0021079-85)によって部分的に資金提供されました。MGAGとURSは、それぞれFundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)とCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES)によって授与された奨学金のおかげです。
Materials
| 140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator | RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China | C180 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I7018 | |
| Acetic acid glacial | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1748 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | A9186 | BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5 |
| Alcohol 70% | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 65350-M | 70% in water |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1662 | |
| Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 555005 | Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells |
| Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 551387 | Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells |
| Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 559864 | Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes |
| Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 553266 | Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors |
| Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 557266 | Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1008 | |
| Automatic pipettes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 4700850N | Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits |
| Beaker | Not applicable | 1 unit | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | A7906 | |
| Cell culture plates (6-well) | Merck, Darmstadt, Germany | Z707759 | 07 units sterile. TPP tissue culture plates |
| Cell culture plates (96-well. Round or V bottom) | Merck, Darmstadt, Germany | CLS353077 | 01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile |
| Chondrogenic medium | Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies | A1007101 | TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l – ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate |
| Collagenase type II | Life Technologies, California, USA | 17101015 | |
| cork or styrofoam board covered with aluminum | Not applicable | 1 unit | |
| cotton | Not applicable | 50 g | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | D4902 | |
| Dissecting scissor | Not applicable | 03 units sterile | |
| DPX Mountant for histology | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 6522 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | D5523 | With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| Eosin B | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 861006 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | F4135 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 47608 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | HT501128 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | G1397 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | H3136 | |
| Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm) | Not applicable | 5 units | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I0200000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I3536 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 563935 | 70% in H2O |
| Ketamine-D4 hydrochloride solution | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | K-006 | 1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant® |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | BR718620 | BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled |
| Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL) | Merck, Darmstadt, Germany | Z645540 | Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile |
| Nichiryo pipette tips (1–10 mL) | Merck, Darmstadt, Germany | Z717401 | Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile |
| Nichiryo pipette tips (200 μL) | Merck, Darmstadt, Germany | Z645516 | Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile |
| Oil-Red O solution | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | O1391 | 0.5% in isopropanol |
| Paraffin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 107.151 | 46–48, in block form |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS). | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile |
| Polypropylene conical tubes (15 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-959-53A | Sterile |
| Polypropylene conical tubes (50 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-432-22 | 2 units sterile |
| scalpel (optional) | Not applicable | 1 unit | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 85228 | |
| Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 72049 | |
| Surgical tweezer (15 cm) | Not applicable | 3 units sterile | |
| Swiss male mice (6–8 weeks) | Bioterium, Santa Cruz State University | 021/22 | |
| syringe (1 mL) | Not applicable | 1 unit | |
| Trypan Blue Dye | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | T3924 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR3263 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | G9422 | BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration) |
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