概要

微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

Published: September 29, 2023
doi:

概要

このプロトコルは、イメージングフローサイトメトリーを使用して微生物の自己凝集を測定するための定量的アプローチを説明しています。

Abstract

有益なプロバイオティクス細菌は、宿主で重要な役割を果たし、感染症に対する免疫を含むさまざまな健康上の利点を提供します。ラクトバチル科は、プロバイオティクスの特性が確認されたグラム陽性菌で構成されています。この研究では、ラクトバチル科の種をモデルとして利用し、細胞凝集の研究におけるシングルセルハイスループット分析の有効性を実証します。焦点は、食事からの単純な炭水化物に対するこれらの有益な種の反応を分析することです。

この研究は、イメージングフローサイトメトリー(IFC)が、炭水化物の存在下と非存在下でのプロバイオティクス細菌の集合における基本的な違いをどのように克服できるかを示しています。IFCは、従来のフローサイトメトリーのパワーとスピードを顕微鏡法の空間分解能と組み合わせることで、有益な細菌株と病態のライブラリー全体で表現型的に定義された方法で、複雑な形態測定を高速に行うことができます。このプロトコルは、ラクトバクラ科の種の自己凝集に関する洞察を提供し、食事性炭水化物に対するそれらの応答に光を当て、これらのプロバイオティクス細菌の有益な効果の背後にあるメカニズムの理解に貢献します。

Introduction

細菌の自己凝集は、バイオフィルム形成の主要なステップと考えられています。このプロセス(自己凝集または凝集とも呼ばれる)では、同じ種類の細菌が多細胞塊を形成し、最終的に培養チューブの底に沈殿するか、標的組織または表面に付着します1

自己凝集は広く観察された現象であり、これまでに日和見病原体Acinetobacter baumannii2、歯科病原体Aggregobacter actinomycetemcomitans3、新興病原体Burkholderia pseudomallei4などのグラム陰性病原体で示されています。自己凝集は、いくつかのプロバイオティクスグラム陽性株5,6,7,8でも記載されています。Lactobacillus (L.) acidophilusでは、自己凝集は部分的にS層タンパク質によって媒介され、キシラン7への接着と相関していました。同様に、プロバイオティクス種であるLacticaseibacillus rhamnosus GGLacticaseibacillus caseiL. acidophilusLacticaseibacillus paracasei、およびLactiplantibacillus plantarumのグルコース依存性自己凝集と接着特性(ムチンへの接着によって判断)の誘導との間に相関関係があることを発見しました5.自己凝集の増加は、グルコースとその異化産物に応答した細胞性アドヘシンの発現の変化を反映している可能性が最も高い9。自己凝集の分子メカニズムはまだ決定されていませんが、このプロセスが凝集した細菌の表現型を変化させ、環境ストレス因子1に対する耐性を高め、クォーラムセンシング分子10に対する感受性を高めることが示されています。

自己集約の測定には、いくつかのアプローチが使用されてきました。1つの実験的アプローチは、培養物を狭い培養チューブに一定時間静的に放置することです。対照培養物は濁ったままですが、自己凝集培養物はチューブの底に沈殿します。より定量的なアプローチは、沈降または沈降アッセイ11による自己凝集を測定する。

フローサイトメトリーは、近年、細菌の自己凝集を調べるためにますます採用されています。この方法は、サイズが約0.5〜1000μmの粒子を分析するのに適しています。単一の細菌または形成された凝集体は、流体中に懸濁され、流れに供給され、1つずつ検出することができる11。前方散乱光を記録することで、細胞または凝集体の相対的なサイズを測定できます。これは比較的高速で簡単ですが、集計サイズや集計内の平均セル数など、いくつかのパラメーターを検出できません。したがって、このアプローチは顕微鏡的に補完することができ、より多くのパラメータをチェックすることができます12。しかし、従来の顕微鏡検査は時間がかかるため、試験するサンプルの数や分析の統計的検出力が制限されていました。一般に、イメージングフローサイトメトリーは、細胞形態および表現型の同時解析、画像ベースの解析の実施、まれな事象の検出、およびフローサイトメトリーデータの検証など、従来のフローサイトメトリーと比較していくつかの特徴を提供する13。これらの利点により、フローサイトメトリーの機能が向上し、細胞集団のより詳細な検査が容易になります。

この研究は、乳酸菌(LAB)の自己凝集をモニターするためのイメージングフローサイトメトリーのための貴重なプロトコルを提供します。これらのグラム陽性桿体は通性嫌気性菌であり、LABグループに属しています。これらの効率的なグルコース発酵槽は、炭水化物代謝14の主な最終産物として乳酸を生成します。これらの細菌は、マイクロバイオームの有益なコアメンバーであり、ヒトや動物の消化管(GIT)だけでなく、女性の泌尿生殖管にも自然に見られます15。したがって、それらの自己凝集特性の正確な特性評価は、バイオテクノロジーおよび臨床で高い関心を集めています。

これまでの知見では、自己凝集の基礎レベルはプロバイオティクス株によって異なることが示されました。この不均一性は、炭素源として使用されるさまざまな炭水化物の影響を受けます5。プロバイオティクス細菌のこの基本的な特性を克服するために、食事からの炭水化物の影響をIFCを使用して単一細胞レベルでの自己凝集にモニターしました。このIFCベースのアプローチは、従来のフローサイトメーターのパワーと速度を顕微鏡の分解能と組み合わせたものです。したがって、表現型的に定義された方法で高速の複雑な形態測定が可能になります16,17。このアプローチは、他のプロバイオティクス細菌や病原性細菌にも適用でき、蛍光レポーターと組み合わせて遺伝子発現をモニターしたり、蛍光標識株と組み合わせて不均一な凝集体中の特定の細菌種の存在と存在量をモニターしたりできます。

Protocol

.ast ファイルは、 例として Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) のテンプレートを含み、 Supplementary Coding File 1 で提供されています。 1. 培地の準備 製造元の指示に従って乳酸桿菌MRSブロス(1 Lの脱イオン水に55 g)と1.5%(w / v)寒天を含む乳酸桿菌MRS寒天プレートを準備します( 材料の表を参照)。オートクレーブ滅菌後、培地は直接?…

Representative Results

この結果は、この方法がLAB細菌の食事糖に対する自己凝集の違いを容易に測定できることを示しています。個体を凝集体から分離することにより、この方法は、食餌からの発酵性または非発酵性の糖に応答して、すべてのイベントのうち、凝集イベントの人口の割合を計算することを可能にする。さらに、治療間で凝集体の母集団の平均サイズに違いがあるかどうかを測定することができま?…

Discussion

フローサイトメトリーは、真核細胞の蛍光強度を定量化するために広く使用されている方法ですが、細菌細胞のサイズが大きいか凝集体が小さいため、細菌細胞の正確な測定が得られない場合があります。これらの要因は、さまざまな条件での自己凝集の正確な定量化と凝集体形成の基礎レベルに大きな影響を与える可能性があります。これに対処するために、イメージングフローサイトメ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、イスラエル科学財団(Grant 119/16)とIKGへのIMoh助成金(3-15656)の支援を受けました。R.S.はクライトマン・フェローシップの支援を受けています。

Materials

14 mL culture tubes Falcon 352051
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Bacto Agar Baeton,Dickinson and Company 214010
Bacto Typtic Soy Broth Baeton,Dickinson and Company 211825
D-(+)-Glucose Sigma G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma 83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth Baeton,Dickinson and Company 288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf) FL medical 23053
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A  Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A  Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Fisher bioreagents BP308-500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific, 174.18 g/mol BP363-1
Potassium phosphate monobasic Sigma, 136.09 g/mol P0662-500G

参考文献

  1. Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
  2. Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces. PLoS One. 7, e48830 (2012).
  3. Inoue, T., et al. Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae. Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).
  4. Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells. Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).
  5. Suissa, R., et al. Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars. Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).
  6. Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota. BMC Microbiology. 21, 268 (2021).
  7. Kos, B., et al. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).
  8. Zommiti, M., et al. In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat "Dried Ossban". Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).
  9. Suissa, R., et al. Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus</em> GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production. bioRxiv. , (2023).
  10. Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).
  11. Misawa, N., Blaser, M. J. Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni. Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).
  12. Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation. Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).
  13. . Imaging flow cytometry. Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).
  14. Wang, Y., et al. Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).
  15. Turroni, F., et al. Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).
  16. Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).
  17. Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis. Methods. 112, 188-200 (2017).
  18. Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).
  19. Maan, H., et al. Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).
  20. Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates. Molecules. 26 (23), 7096 (2021).
  21. Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).

Play Video

記事を引用
Suissa, R., Hadad, U., Meijler, M., Kolodkin-Gal, I. Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation. J. Vis. Exp. (199), e65788, doi:10.3791/65788 (2023).

View Video