汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析

がんは、世界的に高い罹患率と^{死亡率により、}世界的に人々の健康を危険にさらす永続的な公衆衛生問題として浮上しており1、社会に大きな経済的および医学的負担をもたらしています²。近年、がんマーカー^の発見3により、がん治療は大きく進歩し、研究者はがんを治療するための新しい診断法や新薬を開発しています。しかし、がん患者の中には、薬剤耐性、薬剤の副作用、化学物質過敏症などの要因により、依然として予後不良な患者も^{います4。}したがって、早期がんのスクリーニングと治療のための新しいバイオマーカーを特定することが急務となっています⁵。

膜タンパク質は、細胞や細胞小器官膜に結合して統合できるタンパク質です⁶。これらは、膜への結合の強さとその位置に応じて、脂質アンカータンパク質、内在性タンパク質、および末梢膜タンパク質の3つのカテゴリに分類できます^7,8。膜貫通型(TMEM)タンパク質は、少なくとも1つの膜貫通セグメント9からなる内在性膜タンパク質であり、このセグメント^は生体膜を完全または部分的に通過する。

TMEMファミリーに属するタンパク質の作用機序はよくわかっていないが、これらのタンパク質はいくつかの種類のがんに関与していることが知られている¹⁰。いくつかのTMEMタンパク質は、遊走性、増殖性、および侵襲性の表現型と関連しており、それらの発現はしばしば患者の予後と関連しています¹¹。そのため、TMEMファミリーのメンバーが研究対象となっています。TMEMに関する既存の報告を包括的に検討したところ、TMEMは主に細胞間および細胞内のシグナル伝達¹²、免疫関連疾患、および腫瘍形成¹⁰に関連していることが明らかになりました。多くのTMEMは、細胞膜のイオンチャネル、シグナル伝達経路の活性化、細胞走化性、接着、アポトーシス、オートファジーの媒介など、重要な生理学的機能も備えています¹⁰。したがって、TMEMタンパク質は腫瘍の検出と治療における重要な予後マーカーである可能性があるという仮説を立てました。

胃 がん(GC)ではTMEM200A発現が有意に上昇します。染色体6q23.1上に8つのエクソンと77.536 kbの全長を有する TMEM200A¹³の発現が高いことは、GC症例の全生存(OS)の予後不良と関連している。しかし、その発現の変化は、腫瘍学研究でほとんど報告されていません。本稿では、公開されているさまざまなデータセットを用いて、さまざまながん研究における治療標的および腫瘍診断マーカーとしての TMEM200A の有用性を比較・分析する。UCSC XenaおよびTCGAデータベースのRNA-seqデータ、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)、ウェスタンブロッティングを用いて、汎がん診断および予後バイオマーカーとしての TMEM200A の有効性、およびさまざまなヒトがん種における発現レベルを評価しました。

TMEM200A発現レベルが突然変異率、調節プロセス、腫瘍の診断と予後、免疫浸潤、および免疫療法に及ぼす影響を、計算ツールとデータセットのウェブサイトを組み合わせてさらに調査した。CBioPortalおよびCatalog of Somatic Mutations in Cancer Cells(COSMIC)データベースを使用して、TMEM200Aの変異を調べました。SangerboxとTISIDBのウェブサイトは、TMEM200Aが免疫浸潤にどのように影響するかを理解するために利用されました。Tumor Immune Single Cell Center(TISCH)のオンラインツールとCancerSEAデータベースを使用して、TMEM200Aの機能を調査しました。最後に、GC細胞の悪性挙動および腫瘍発生機能に対するTMEM200Aの影響を評価するために、in vitroアッセイで機能喪失実験を実施しました。さらに、ウェスタンブロッティングを実施して、ノックダウンTMEM200A PI3K/AKTシグナル伝達経路およびGCの上皮間葉転換(EMT)にどのように影響するかを評価しました。

1. Cancer Genome Atlas(TCGA)データベース

注: Cancer Genome Atlas(TCGA) データベースには、さまざまな腫瘍組織における遺伝子の配列決定データが含まれています¹⁴。100万分の1(TPM)フォーマット TMEM200A 転写産物の研究のためのTCGAのRNA-seqデータを UCSC Xena のWebサイト¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/)から抽出し、サンプル間の発現を比較するためにlog2を変換しました。

1. UCSC Xena の Web サイト インターフェイスに移動します。
2. [ Xenaの起動 ]タブをクリックします。
3. 画面上部の [DATA SETS ] タブをクリックします。
4. このページの 129 のコホートと 1,571 のデータセットから、 GDC TCGA 急性骨髄性白血病 (LAML)、GDC TCGA 副腎皮質がん (ACC)、GDC TCGA 胆管がん (CHOL) など、合計 33 のがんのタブをクリックします。
5. gene expression RNAseq メニューから HTSeq - FPKM GDC Hub タブを選択してクリックします。
   注: HTSeq - FPKM GDC ハブ は、同意によって修正されたデータを表します。
6. ダウンロードメニューから、対応するリンクをクリックします。
   注:上記の方法により、33種類のがんのRNA-Seqデータがダウンロードされました。
7. 33種類のがんのRNA-seqデータのzipアーカイブを、コンピューターのデスクトップフォルダーにある1つのファイルに解凍します。
8. 解凍したtxtファイルを同じフォルダに統合し、Perlスクリプトをこのフォルダに配置します。
9. Perlソフトウェアを開き、フォルダのパスをコピーして、マウスカーソルが置かれているPerlソフトウェアに貼り付け、Enterキーを押し、Perlコードの名前と遺伝子の名前(TMEM200A)を入力し、Enterキーを押して新しいtxtファイルを取得します(singleGeneExp.txt)。
   注:この新しいtxtファイル(singleGeneExp.txt)には、さまざまな患者の33の癌における TMEM200A の遺伝子発現が含まれています。
10. R コード (diffR) を開き、 singleGeneExp.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd がある行に貼り付けます。
11. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(diffR)を実行し、「ggpubr」パッケージを使用して画像を描画します。

2. TIMER2.0データベース

1. TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) database ¹⁶ の Web サイト インターフェイスに移動します。
2. [Cancer Exploration] タブをクリックします。
3. 検索ボックスに遺伝子ID(TMEM200A)を入力し、[ 送信 ]タブをクリックして、さまざまな種類の腫瘍における TMEM200A の発現差画像を取得します。

3. ヒトプロテインアトラス(HPA)

1. Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷ウェブインターフェースに移動します。
2. 検索ボックスに「ID(TMEM200A)」と入力し、[検索]ボタンをクリックします。TISSUE sub-atlasを選択します。
3. ページにカーソルを合わせ、下にスクロールして[ Protein Expression Overview ]タブを見つけます。
   注: タンパク質発現の概要 セクションには、人体の45の臓器における TMEM200A のタンパク質発現レベルが表示されます。

4. HumanMethylation450 Illumina Infinium DNAメチル化プラットフォームアレイ

注: HumanMethylation450 Illumina Infinium DNAメチル化プラットフォームアレイ を使用して、メチル化に関するデータを収集しました。 TMEM200A DNAメチル化レベルは、 SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)データベース¹⁸を用いて評価できた。

1. SMARTにアクセスします webサイトインターフェイス。
2. 検索ボックスに遺伝子ID(TMEM200A)を入力して、染色体内のTMEM200A分布と、さまざまな種類の悪性腫瘍におけるTMEM200Aのメチル化レベルを取得します。
3. ページを下にスクロールしてClick to check CpG-aggregated methylation メニューを表示し、[ Plot ]ボタンをクリックします。ページの下部にある [ Download Figure ] ボタンを見つけてクリックします。図をダウンロードしてください。

5. UALCANデータベース

1. UALCANに移動します webサイトインターフェイス。
   注:さまざまな悪性腫瘍におけるTMEM200Aプロモーターメチル化レベルの箱ひげ図は、UALCANデータベース(http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹を通じて生成されました
2. ページ上部の TCGA ボタンをクリックします。
3. 画面の Gene ID 入力ボックスに TMEM200A を入力します。 TCGAデータセット メニューで、下にスクロールして、照会するがんの種類を選択します。
4. [探索]ボタンをクリックした後、[分析用リンク]メニューのサブグループ分析[メチル化]をクリックして、この腫瘍のメチル化結果を取得します。
   注:この方法により、 UALCAN データベース内の22の腫瘍のメチル化結果が得られました。

6. がん細胞の体細胞変異カタログ(COSMIC)データベース

1. Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) の Web サイト インターフェイスに移動します。
   注:ヒトゲノムにおけるコード変異、非コード変異ゲノム再構成、および融合遺伝子に関するデータは、 Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) database²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)から入手でき、これは、種々の癌における種々のTMEM200A 変異の頻度を決定するためにも使用される。
2. 検索ボックスに遺伝子ID(TMEM200A)を入力し、 SEARCH ボタンをクリックすると新しい画面に移動します。
3. Genes メニューで、TMEM200Aの遺伝子 ID 名が表示されているリンクを見つけてクリックします。
4. 新しいページで [ Mutation distribut grouping] (変異分布のグループ化) 列を見つけて、腫瘍の TMEM200A の変異状態を取得します。

7.CBioポータル

1. CBioPortalのWebサイトインターフェイスに移動します。
   注:がんゲノミクスデータは、cBioPortal(www.cioportal.org)データベースを使用して検索、ダウンロード、分析、および視覚化できます。体細胞変異、DNAコピー数変化(CNA)、mRNAおよびマイクロRNA(miRNA)発現、DNAメチル化、タンパク質量、リン酸化タンパク質量は、cBioPortal²¹によって統合されるゲノムデータタイプのほんの一部です。cBioPortalでは、幅広い研究を行うことができます。しかし、主な重点は、突然変異とその可視化に関連するさまざまな分析にあります。
2. Select Studies for Visualization & Analysis セクションの PanCancer Studies サブセクションから Pan-cancer analysis of whole genomes データセットを選択します。次に、[Query By Gene] ボタンをクリックします。
3. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。[Submit Query] ボタンをクリックします。
4. ページ上部の [ がんの種類 の詳細] ボタンをクリックして、さまざまな種類のがんの TMEM200A の変異を取得します。

8. Sangerbox 3.0 ツール

1. Sangerbox 3.0 ツール インターフェイスに移動します。
   注:すべての癌における 免疫 浸潤細胞、免疫抑制剤、免疫賦活因子、およびMHC分子(主要な組織適合遺伝子複合体)とのTMEM200A発現の相関関係は、Sangerbox 3.0ツール²² (http://vip.sangerbox.com/)の汎癌免疫浸潤データを使用してCIBERSORT免疫浸潤によって分析されました。
2. ページ左側のツールバーから、Pan-Cancer AnalysisメニューからImmunocellular Analysis (CIBERSORT)タブを選択してクリックします。
3. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。「送信」ボタンをクリックします。

9. TISIDBデータベース

1. TISIDB の Web サイト インターフェイスに移動します。
   注: TISIDBデータベース²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/)は、さまざまな癌における免疫浸潤細胞、免疫抑制剤、免疫賦活因子、およびMHC分子とのTMEM200A 発現との相関を調べるために採用されました。
2. Enter GenesのクエリボックスにターゲットのGene Symbol(TMEM200A)を入力します。「送信」ボタンをクリックします。
3. ページ上部のリン パ球、免疫調節剤、ケモカイン、および サブタイプの セクションをクリックします。ページ下部の関連画像をダウンロードします。

10. TIDEデータベース

1. TIDEにアクセスします webサイトインターフェース。
   注:TIDEデータベース(http://tide.dfci.harvard.edu/)は、腫瘍免疫チェックポイント遮断療法に対する反応を予測するためのバイオマーカーとしてのTMEM200A の可能性を評価するために使用されました。
2. 初期画面でメールアドレスを入力してアカウントを登録し、ログインします。
3. ページ上部の 「Biomarker Evaluation 」サブセクションを見つけてクリックします。
4. ページ下部のEnter Genesのクエリボックスにターゲット遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。次に、「送信」ボタンをクリックします。
5. ページ内でマウスをドラッグしてページを下にスライドし、分析の結果を確認します。

11. CancerSEAデータベース

1. CancerSEAのWebサイトのインターフェイスにアクセスします。
   注:シングルセルシーケンシングデータを用いて、 TMEM200A 発現と異なる腫瘍細胞の機能状態との関係を調べました。これは、 CancerSEAデータベース²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)を用いて行った。
2. ページの上部にある [ 検索 ] タブを見つけてクリックします。
3. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。「送信」ボタンをクリックします。

12.腫瘍免疫シングルセルセンター(TISCH)ネットワークツール

1. 腫瘍免疫単一細胞センター(TISCH)ネットワークツールのWebサイトインターフェイスに移動します。
   注: TMEM200A 細胞と癌細胞の発現レベルとの相関は、腫瘍免疫単一細胞センター(TISCH)ネットワークツール²⁵を用いても示された。
2. Enter Genesのクエリボックスに標的遺伝子ID(TMEM200A)を入力します。[探索] ボタンをクリックします。
3. このページの [がんの種類 ] メニューで、[ All Cancers ] データセットを選択してクリックします。次に、ページを下にスクロールして、[ 検索 ]ボタンをクリックします。

13.ジェネマニア

1. GeneMANIAのWebサイトインターフェイスに移動します。
   注:TMEM200Aとその機能的に関連する遺伝子との相関は、遺伝子間相互作用(GGI)ネットワークを構築するための遺伝子多会合ネットワークWebsite GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶の統合戦略を用いて予測された。
2. ページの左上にある 検索 ボックスに、遺伝子ID(TMEM200A)を入力し、 検索ツールをクリックします。
   注: GeneMANIA ウェブツールを使用して、 TMEM200Aに関連する20個の遺伝子を見つけました。

14. 機能エンリッチメント分析

1. 濃縮のために解析する遺伝子のシンボルIDをtxtファイル形式で保存します。
2. R コード (symbolidR) を開き、上記の txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
3. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (symbolidR) を実行します。これらの遺伝子のシンボルIDを「org.Hs.eg.db」パッケージ。 id.txt ファイルを取得します。
4. R コード (GOR と KEGGR) を開き、 id.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
5. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (GOR と KEGGR) を実行します。このプロトコルに従うには、パッケージ「clusterProfiler」、「org.Hs.eg.db」、および "enrichplot" を実行し、パッケージ "gglot2" を使用してエンリッチメント結果をプロットします。

15. 遺伝子活性の違いの解析

注:各がんサンプルのTMEM200Aスコアリングは、ssGSEA(単一サンプル遺伝子セット濃縮分析)²⁷を使用して計算され、さまざまながんについて、がん組織と健康な組織におけるTMEM200A遺伝子活性の差動分析が行われました。

1. ステップ1.7でダウンロードした33種類の腫瘍のRNA-seqデータに基づいて、ダウンロードしたすべてのファイルを解凍し、統一されたフォルダに配置します。
2. 上記のフォルダに merge.txt ファイルを配置します。
   注:BioWolf(www.biowolf.cn)のmerge.txtファイルのデータには、がんゲノムアトラス(TCGA)データベース内のすべての腫瘍のすべての患者の遺伝子発現が含まれています。
3. R コード (ssGSEAR) を開き、上記のフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
4. R コード (ssGSEAR) の geneName がある行を取り、遺伝子 ID (TMEM200A) を入力します。
5. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(ssGSEAR)を実行します。遺伝子活性のスコアリングファイルを取得します: scores.txt。
   注:ssGSEAアルゴリズムでは、 まず、merge.txt ファイルで提供されたデータに従って、遺伝子間の相関係数に基づいて遺伝子セットファイルを構築し、そのファイルから標的遺伝子(TMEM200A)との相関が高い遺伝子を同定します。そして、相関性の高い遺伝子を TMEM200Aの活性遺伝子として統一し、最後に各サンプルの活性遺伝子のスコアリングを求めます。
6. R コード (scoreDiffR) を開き、scores.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コード内の setwd がある行に貼り付けます。
7. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (scoreDiffR) を実行し、"plyr"、"reshape2"、および "ggpubr" パッケージを使用して画像を描画します。

16. 臨床病理学的相関と生存予後解析

1. UCSC Xena の Web サイト インターフェイスに移動します。
2. [ Launch Xena ]タブをクリックします。
3. 画面上部の [DATA SETS ] タブをクリックします。
4. ページにカーソルを合わせ、下にスクロールして TCGA Pan-Cancer (PANCAN) タブを見つけます。
5. このページの 129 のコホートと 1,571 のデータセットから、[ TCGA Pan-Cancer (PANCAN)] タブをクリックします。
6. 表現型メニューから、[キュレーションされた臨床データ]タブを選択してクリックします。
7. ダウンロードメニューから、対応するリンクをクリックします。
   注:上記のリンクからTCGAデータベースから33のがんの臨床データをダウンロードしてください。
8. ダウンロードした臨床データファイルを解凍し、解凍したファイルをxlsファイル形式で開きます。
9. 必要な臨床データ(病期、年齢、病態、病状)をファイルに整理して保持し、残りの不要な臨床データを削除し、ファイル名を「clinical」に変更してファイル全体をtxt形式のファイルとして保存します。
10. 手順1.9で取得した singleGeneExp.txt に基づいて、このファイルを整理 されたclinical.txt ファイルと同じフォルダーに配置します。
11. ダウンロードした臨床データを解凍し、解凍した臨床ファイルと同じフォルダに singleGeneExp.txt ファイルと clinical.txt ファイルを配置します。
12. R コード (clinicalDiffR) を開き、上記のフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
13. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(clinicalDiffR)を実行し、「ggpubr」パッケージを使用して画像を描画します。
14. UCSC Xena の Web サイト インターフェイスに移動します。
15. [ Launch Xena ]タブをクリックします。
16. 画面上部の [DATA SETS ] タブをクリックします。
17. このページの 129 のコホートと 1,571 のデータセットから、 GDC TCGA 急性骨髄性白血病 (LAML)、GDC TCGA 副腎皮質がん (ACC)、GDC TCGA 胆管がん (CHOL) など、合計 33 のがんのタブをクリックします。
18. 表現型メニューから、生存データタブを選択してクリックします。
19. ダウンロードメニューから、対応するリンクをクリックします。
20. 33種類のがんの生存データのzipアーカイブを、コンピューターのデスクトップフォルダーにある1つのファイルに解凍します。
21. 解凍したサバイバルデータは、手順1.9で取得した singleGeneExp.txt ファイルと同じフォルダに入れます。
22. R コード (preOSR) を開き、上記のフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
23. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (preOSR) を実行します。「limma」パッケージを使用して計算し、汎がんにおける TMEM200A の生存に関するデータファイルを取得します: expTime.txt。
24. R コード (OSR) を開き、 expTime.txt ファイルが配置されているパスをコピーして、R コード内の setwd が配置されている行に貼り付けます。
25. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (OSR) を実行します。expTime.txtファイルのデータに基づいて「survival」および「survminer」パッケージを使用してKM分析を実行し、汎がんのTMEM200Aの生存曲線をプロットします。

17. フォレストプロット構築による単変量および多変量Cox回帰分析

1. R コード (COXR) を開き、16.23 から expTime.txt ファイルを取得したパスをコピーして、R コードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
2. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (COXR) を実行します。 expTime.txt ファイルのデータに基づいて、「survival」、「survminer」、および「forestplot」パッケージを使用して単変量COX回帰分析を実行し、さまざまながんの TMEM200A の単変量フォレストプロットをプロットします。
3. 手順16.23の expTime.txt ファイルと手順16.10の clinical.txt ファイルを同じフォルダに配置します。
4. R コード (multicoxR) を開き、手順 16.23 の expTime.txt ファイルと手順 16.10 の clinical.txt ファイルを含むフォルダーが配置されているパスをコピーして、R コードで setwd が配置されている行に貼り付けます。
5. R ソフトウェアを開き、変更した R コード (multicoxR) を実行します。"survival" パッケージと "survminer" パッケージを使用して多変量 COX 回帰分析を実行し、expTime.txt ファイルと clinical.txt ファイルのデータに基づいて、さまざまながんのTMEM200Aの多変量フォレスト プロットをプロットします。

18. TMEM200A 発現と臨床的特徴に基づく胃癌の予後モデル

1. 手順16.10の clinical.txt ファイルと手順16.23の expTime.txt ファイルを同じフォルダに配置します。
2. Rコード(NomoR)を開き、上記のtxtファイルが配置されているパスをコピーして、Rコードの setwd が配置されている行に貼り付けます。
3. Rソフトウェアを開き、変更したRコード(NomoR)を実行します。ソフトウェアパッケージ「survival」、「regplot」、および「rms」を使用して、GCおよび臨床データの 発現データTMEM200A 、患者の生存を予測するための予後モデルを構築します。

19. TMEM200Aの細胞培養とsiRNAトランスフェクション

注:ヒトSTAD HGC-27細胞、SGC-7901細胞、およびヒト胃粘膜上皮 GES-1細胞 を商業的に入手し( 資料表を参照)、蘇生し、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640完全培地(10%のウシ新生仔胎児血清および1%ペニシリン混合物を含む)で接種し、5%_CO2 中で37°Cで培養した細胞培養インキュベーター。培地は2〜3日ごとに交換した。良好な増殖状態にある細胞を、(2〜3)に従って6ウェルプレートに接種し×10⁵ 細胞/ウェルとした。

1. まず、3本の微量遠心チューブを用意し、各チューブに8 μLのトランスフェクション試薬(材料のTを参照)と200 μLの基礎培地を加えます。次に、SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3 をそれぞれ 4 μg ずつ各チューブに添加します。
   注: TMEM200A ノックダウンのために、siRNAを設計し、購入しました( 材料表を参照)。
2. 3本の微量遠心チューブで混合物を完全に混合し、6ウェルプレートの3つのウェルのそれぞれに加えます。6ウェルプレートを静かに振って、混合物を均等に分散させます。混合物を添加した 3 つのウェルを SiRNA-1、SiRNA-2、および SiRNA-3 とラベル付けします。
3. 細胞を4〜6時間インキュベートしたら、6ウェルプレートの3つのサブウェルの培地の半分を交換します。
   注意: 完全な培地の半分を交換する場合は、元の完全な培地の半分を吸引し、新しい完全な培地の半分を補充します。
4. 24〜48時間後、siRNAトランスフェクションした 細胞TMEM200A 実験群として使用し、トランスフェクションしていない細胞をネガティブコントロールグループとして使用します。 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR、 セクション20を参照)を実施して、細胞に対するトランスフェクションの効果を評価します。

20. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応

1. 各サブグループの細胞培養培地を廃棄し、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回穏やかに洗浄します。
2. RNA単離キットを使用してトータルRNAを単離します( 材料表を参照)。
3. メーカーの指示に従い、 cDNA Synthesis Kitを使用してRNA濃度を推定し、1 μgのRNAでcDNAを合成します。
4. リアルタイムPCRアッセイシステムを使用して、GAPDH(標準化用)、TMEM200A(材料表を参照)、qPCRマスターミックス用のヒト特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、10 μLの反応混合物中のcDNAを10倍希釈して定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を実施します。
   注:各実験を3回に分けて実行してください。
5. 以下のqPCR反応条件を使用します:初期化、95°Cで3分間。変性、95°Cで10秒。焼きなまし、60°Cで30秒。伸長、80°Cで10秒。変性、アニーリング、伸長を40回繰り返します。^2-ΔΔCt技術を用いて各遺伝子の相対発現を決定する²⁸。
6. 実験を少なくとも3回繰り返して、生物学的トリプリケートを取得します。

21. 関連するタンパク質発現のウェスタンブロット検出

1. 各サブグループの細胞培養培地を廃棄し、2 x 1 mLのPBSで細胞を静かに洗浄します。
2. 細胞を含む6ウェルプレートを氷上で冷却し、150 μLの予冷した無線免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファー(150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、50 mM Tris-HCl pH 8.0、および新たに添加したプロテアーゼ阻害剤カクテル)を加えます。溶解を氷上で10分間進行させます。
3. プラスチック製の細胞スクレーパーを使用して、ディッシュから付着した細胞を取り除き、細胞溶液を予冷された微量遠心チューブに繊細に移します。
4. 細胞溶解物を4°Cで1.5×104gで10分間遠心分離します。 上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。 
5. BCAタンパク質アッセイキットを利用して、メーカーの指示に従ってタンパク質含有量を測定します。
6. 各サンプルから30 gのタンパク質を10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルにロードし、80 Vで0.5時間泳動した後、120 Vで1.5時間泳動します。
7. タンパク質をゲルから45μmのポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに300mAの電圧で1〜1.5時間移します。
8. PVDFメンブレンをシェーカーに置き、3 x 5分間振とうした後、Tween 20(TBST、20 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、および0.1% Tween 20)を含むTris緩衝生理食塩水を、タンパク質側(ゲル側)を上に向けて適切な容器に加えます。
9. メンブレンをブロッキングバッファー( 材料表を参照)に入れ、室温で0.5時間インキュベートします。
10. メンブレンをTBSTで3 x 10分間洗浄します。
11. リン酸化AKT(p-AKT;1:1,000)、総 AKT 1:1,000、E-カドヘリン(E-ca;1:1,000)、N-カドヘリン(N-ca;1:1,000)、 ビメンチン 1:1,000、 カタツムリ 1:1,000、 TMEM200A 1:1,000、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH;1:1,000)に対する一次抗体をメンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。
12. メンブレンを3 x 10分間洗浄し、メンブレンをウサギまたはマウスの二次抗体(1:5,000)とともに室温で1時間インキュベートします。
13. PVDFメンブレンをECL基質と30秒間インキュベートし、イメージングシステムを使用してシグナルを検出します。

22. CCK-8アッセイ

1. ヒトSTAD HGC-27 細胞を良好な増殖状態で96ウェルプレートに播種します。
2. 細胞密度が60〜70%に達したら、 細胞にTMEM200A siRNA をトランスフェクションします(ステップ19.3と同様)。
3. トランスフェクションした細胞を5×10 ³/ウェルの細胞密度で96ウェルプレートに播種し(セルカウンターを使用して生細胞をカウント)、 NC および TMEM200A siRNAグループ に分割し(各グループに3つの複製ウェルを使用)、37°Cでインキュベートします。
4. 0、24、48、72、96時間後にCCK-8試薬を添加し、37°Cで2時間インキュベートします。吸光度(450nm)を多機能酵素ラベラーで測定します。

各種がんにおける TMEM200A 発現
図1に示すように、まず、さまざまなデータベースを使用して、さまざまながんのTMEM200Aの発現レベルの違いを分析しました。TMEM200A発現は、TCGAデータのみに基づく隣接する正常組織と比較して、胆管癌(CHOL)、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、腎明細胞癌(KIRC)、腎乳頭状細胞癌(KIRP)、肝細胞癌(LIHC)、STAD、および甲状腺癌(THCA)で上昇しました。しかし、膀胱尿上皮がん(BLCA)、子宮頸部扁平上皮がんおよび子宮頸部腺がん(CESC)、多形性膠芽腫(GBM)、腎嫌色症(KICH)、肺扁平上皮がん(LUSC)、褐色細胞腫および傍神経節腫(PCPG)、直腸腺がん(READ)、および子宮体子宮内膜がん(UCEC)では、TMEM200A発現が減少しました(図2A)。TIMER2.0データベースでは、CHOL、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC、およびSTADでTMEM200A発現が増加しました。さらに、BLCA、CESC、GBM、KICH、LUSC、PCPG、READ、皮膚皮膚黒色腫(SKCM)、およびUCECでTMEM200A発現が増加しました(図2B)。

2つのデータベースの結果を比較したところ、 TMEM200A の汎がん発現はどちらのデータベースでも同じであることがわかりました。TCGAデータベースからがん患者33例の臨床追跡データとRNAシークエンスデータを取得し、ssGSEA解析を用いて各がん検体の スコアリングTMEM200A 算出し、多くの腫瘍の腫瘍および正常組織における TMEM200A 遺伝子活性を算出した。 TMEM200A はGBM、HNSC、腎臓KIRC、THCAで高発現していることを発見しました(図2C)。したがって、 TMEM200A の遺伝子活性は、各腫瘍組織でランク付けされました。 TMEM200A の遺伝子活性は、KIRCで最も高く、ぶどう膜黒色腫(UVM)で最も低いことがわかりました(図2D)。その後、ヒト組織における TMEM200A 発現レベルをHPAデータベースで評価したところ 、TMEM200A 発現レベルはほとんどの正常組織で低いが、副腎皮質、直腸、子宮内膜、平滑筋では高いことが示されました(図2E)。

正常組織細胞株では、顆粒膜細胞、双極細胞、骨格筋細胞、子宮内膜間質細胞、T細胞などの少数の細胞株で TMEM200Aの高い発現を示しましたが、他のほとんどの細胞株では TMEM200A 発現が低かった(図2F)。また、HPAデータベースの免疫組織化学(IHC)データを調べ、 タンパク質レベルでのTMEM200A 発現を調べました。染色と強度に関するデータから、大腸がん(CRC)、肺がん(LUAD)、肝臓がん(LIHC)、乳がん(BRCA)、前立腺がん(PRAD)の組織では、正常組織と比較して、 TMEM200A の発現レベルがはるかに高く、より顕著であることが明らかになりました(図2G)。これらの知見は 、TMEM200A がさまざまながんに広く発現し、さまざまな腫瘍で異なるメカニズムを介してがんの発生に影響を与えることを示唆しています。

臨床病理学的関係と生存予後
33例のヒト悪性腫瘍について、UCSC XenaデータベースのウェブサイトからTCGA汎がん(PanCan)コホートの情報と臨床データを収集し、PanCanにおける TMEM200A 発現と年齢、病理学的悪性度、臨床病理学的病期、および患者の生存状態との相関を調査しました。この研究では、BLCA、浸潤性乳がん(BRCA)、食道がん(ESCA)、KIRP、SKCM、精巣がん(TGCT)を含む6つのがんにおいて、 TMEM200A の発現が臨床病理学的病期と関連していることが明らかになりました(図3A)。浸潤性BRCA、膠芽腫、急性骨髄性白血病(LAML)、SKCM、胸腺がん(THYM)、子宮内膜がん(UCEC)の6つの腫瘍と年齢は相関していた(図3B)。病理学的悪性度は、食道がん(ESCA)、HNSC、KIRC、低悪性度脳神経膠腫(LGG)、膵腺がん(PAAD)、子宮内膜がん(UCEC)を含む6つの腫瘍と関連していた(図3C)。生存状態は、副腎皮質がん(ACC)、BLCA、KIRC、PCPG、およびぶどう膜黒色腫(UVM)を含む5つの腫瘍と関連していた(図3D)。

TMEM200A発現と予後の相関関係についてさらに詳しく知るために、中央値群閾値を用いた一元配置Cox回帰分析を用いて、OS、DSS、PFI、DFIのさまざまながんについて研究を実施した。OS解析の結果、副腎皮質がん(ACC)(P = 0.037)、BLCA(P = 0.036)、急性骨髄性白血病(LAML)(P = 0.011)、GC(STAD)(P = 0.005)の4つの腫瘍では、4つの腫瘍のうち、TMEM200A発現が高いほどOS予後への影響が大きいことが明らかになった。対照的に、TMEM200A発現が高いほど、KIRC(P < 0.001)、KIRP(P = 0.020)、低悪性度脳神経膠腫(LGG)(P = 0.042)、PCPG(P = 0.002)、および皮膚黒色腫(SKCM)(P = 0.043)の5つの腫瘍でOSの予後が良好であった(図3E、F)。DSSでは、副腎皮質がん(ACC)(P = 0.026)およびBLCA(P = 0.015)を含む2つの腫瘍型で高TMEM200A発現は予後不良であった。高TMEM200A発現は、KIRC(P < 0.001)、KIRP(P = 0.001)、低悪性度脳神経膠腫(LGG)(P = 0.025)、およびPCPG(P = 0.007)の4つの腫瘍タイプで予後が良好であった(図3G)。また、PFIについては、副腎皮質がん(ACC)(P=0.007)、BLCA(P=0.040)、ぶどう膜黒色腫(UVM)(P=0.020)の3種類の腫瘍で、TMEM200A発現が高いほど予後不良が認められました。TMEM200A発現が高いほど、脳のKIRC(P < 0.001)および低悪性度神経膠腫(LGG)(P = 0.044)を含む2種類の腫瘍で予後が良好であった(図3H)。DFIでは、TMEM200Aの発現が高いほど副腎皮質がん(ACC)の予後が不良でした(P = 0.044)(図3I)。

その後、マルチCOX回帰分析のためにいくつかの腫瘍(KIRCおよびKIRP)を選択しました。その結果、TMEM200Aは他の臨床因子と比較して、がん患者の生存率に個別に影響を与える可能性があることが示されました(図3JおよびK)。これらの結果は、TMEM200Aがさまざまながんの独立した生予後マーカーとして使用され、がん患者の生存に影響を与える可能性があることを示しました。

DNAメチル化解析
最も注目されているエピジェネティックな変化の1つは、DNAメチル化である29。エピジェネティックな変化の一種であるDNAメチル化は、腫瘍の成長に大きな影響を与えることが示唆されている30。そこで、SMARTデータベースを用いて、正常組織とがん組織における TMEM200A のDNAメチル化レベルを評価しました。PAADおよびPRAD組織は、正常組織よりも TMEM200A のDNAメチル化レベルが高かった。しかし 、TMEM200A では、COAD、KIRC、KIRP、LIHC、LUSC、READ、THCA、およびUCECのDNAメチル化レベルが正常組織よりも低かった(図4A)。 TMEM200A のDNAメチル化レベルは、UALCANデータベース(図4B)に基づくKIRP、PRAD、PCPG、およびTHYMのTCGAデータベースでは有意に高かったが、BLCA、BRCA、CHOL、COAD、CESC、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、PAAD、READ、TGCT、STAD、THCA、およびUCECでは有意に高かった。 TMEM200A のメチル化レベルは、LUSC、PAAD、READ、TGCT、STAD、THCA、およびUCECで有意に低下しました(図4C)。 TMEM200A の発現量とDNAメチル化および臨床病理学的因子との関係をさらに調べるために、再びSMARTデータベースを利用し、BLCA、HNSC、LUAD、およびSTADの TMEM200A のDNAメチル化レベルが病理学的病期とともに変化することを発見しました(図4D)。臨床的要因は、上記の腫瘍における TMEM200A のDNAメチル化のレベルに影響を与える。

遺伝子変異解析
腫瘍の発生理由の1つは、遺伝子変異の蓄積である31。そこで、cBioPortalデータベースを用いて汎がん臨床検体におけるTMEM200A変異の頻度を推定することにより、体細胞TMEM200A変異の頻度を解析した。TMEM200Aは、肺がん、子宮内膜がん、黒色腫、食道胃がん、骨がん、子宮頸がん、肝胆道がん、成熟B細胞リンパ腫、BRCA、子宮内膜がん、卵巣がん、胎児性腫瘍、膵臓がん、頭頸部がん、大腸がん、神経膠腫、非小細胞肺がん、軟部肉腫、原発不明がんなど、多くのがんに変異しています(図5A).さらに、DNAの変化は、タンパク質レベルでの構造的またはアミノ酸的変化につながる可能性があります。図5BにTMEM200Aの3D構造を示す。cBioPortalデータベースを用いて、TMEM200Aのアミノ酸に変異部位を発見しました。ミスセンス変異は、最も一般的な変異形態であった(図5C)。

Sangerbox 3.0を用いてデータを解析し、変異部位の精度を検証したところ、前回と同じ結果が得られました。ミスセンス変異は 、TMEM200A における変異の最も頻繁な形態であり、SKCMでは7.8%もの頻度で発生する可能性がある(図5D)。ミスセンス変異とは、あるアミノ酸をコードするコドンが塩基置換され、別のアミノ酸をコードするコドンとなり、ポリペプチド鎖のアミノ酸の種類や配列が変化する変異です。ミスセンス突然変異の結果は、通常、ポリペプチド鎖が本来の機能を失うことです。多くのタンパク質異常は、腫瘍の突然変異の一般的なタイプであるミスセンス突然変異によって引き起こされます。ミスセンス変異はタンパク質の安定性に重要な役割を果たしており、変異の存在はタンパク質間の結合親和性に有意な影響を及ぼし、タンパク質と周囲の相関高分子33との間の相互作用を変化させる可能性があることがわかっている。

したがって、ミスセンス変異は、異なる癌における膜貫通タンパク質200Aの生物学的機能に影響を及ぼす可能性が最も高い。 またTMEM200A 遺伝子変異とがん患者の臨床的生存予後との相関も調べた。OSの可能性は 、TMEM200A変異群と比較して増加したが、無病群では増加しなかった(図5E)。遺伝子相関の研究により 、TP53、AKAP7、TAAR5、TAAR1、MOXD1、THEMIS、VNN2、ENPP3、TMEM244、 および SLC18B1 が TMEM200A と共変異する遺伝子であることが明らかになりました(図5F)。COSMICデータベースを通じて、いくつかの変異タイプと一塩基変異(SNV)を同定し、GCにおける TMEM200A 変異についてさらに学ぶことができました。ミスセンス置換の頻度が最も高く(38.86%)(図5G)、SNVデータによると、STADで最も一般的なSNVはG>A(31.73%)であり、次いでC>T(26.35%)、G>T(11.73%)でした(図5H)。

がん TMEM200A の単一細胞解析
TISCH(Tumor Immunology Single Cell Center)のウェブサイトを用いて、異なる単一細胞におけるTMEM200A発現レベルを解析しました。TISCHオンラインツールは、図6Aに示すヒートマップに、65のデータセットと28の細胞タイプのTMEM200Aの発現を表示しました。その結果、TMEM200Aは主にCD8+ T細胞と線維芽細胞で発現していることが示されました。転移性皮膚黒色腫(SKCM)患者の細胞を含むGSE72056データセットは、この点で注目に値する。TMEM200Aは、SKCM微小環境において、B細胞、CD4+ Tリンパ球、枯渇CD8+ T細胞、内皮細胞、線維芽細胞、およびその他の細胞タイプで広く高発現していました(図6B、C)。大腸がん患者の細胞を含むGSE146771データセットでは、大腸がん微小環境におけるB細胞、CD4+ Tリンパ球、CD8+ T細胞、枯渇CD8+ T細胞、内皮細胞、線維芽細胞、およびその他の細胞タイプでTMEM200Aが広く高発現していました(図6D、E)。CancerSEAデータベースを用いて、特定の腫瘍細胞におけるTMEM200Aの発現レベルと機能状態を決定しました(図6G)。 TMEM200A発現は、神経膠芽腫(GBM)、肺腺がん(LUAD)、慢性顆粒球性白血病(CML)、大腸がん、網膜芽細胞腫(RB)、ぶどう膜黒色腫(UM)など、さまざまながんの細胞機能状態と強く相関していました。血管新生、アポトーシス、分化、および炎症はすべて、大多数の腫瘍細胞でTMEM200A発現と正の相関がありましたが、DNA損傷、DNA修復、浸潤、および代謝はTMEM200A発現と負の相関がありました(図6F)。

各種がんにおけるTMEM200Aの機能的・経路濃縮解析
GGIネットワークを用いて 、TMEM200A と類似した機能を持つタンパク質との関連を調べ、異なるがんにおける TMEM200A の機能を調べました(図7A)。ゲノムおよびプロテオミクス情報は、標的遺伝子のクエリリストを使用してGeneMANIAによって分析されます。 TMEM200Aに似た働きをする遺伝子を突き止めることで、この遺伝子と直接相互作用する40種類のタンパク質を発見しました。これらの遺伝子の相関関係は、PPIネットワークによって示されています(図7B)。その後、 TMEM200A に密接に関連するこれら20の遺伝子のGOおよびKEGGエンリッチメント解析により、これらの隣接する遺伝子がRNAの遺伝子サイレンシングの負の制御に大きく関与していることが明らかになりました。KEGG解析により、 Wnt シグナル伝達経路や細胞老化などの経路にTMEM200Aが豊富に存在することが明らかになりました(図7C)。GO濃縮解析では、分子機能において、 TMEM200A は主にカルシウムチャネルに豊富に存在し、RNAによる遺伝子サイレンシングの負の制御が示されました(図7D)。

TMEM200Aと免疫浸潤の相関解析
さらに、TMEM200A発現と免疫細胞浸潤の相関関係を調べ、TMEM200Aとがん免疫の相関関係を実証しました。Sangerbox 3.0汎がんデータを用いてCIBERSORT免疫浸潤解析を実施した。その結果、汎がんTMEM200A発現は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、B細胞、ヘルパーT細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、および顆粒球と相関していることが示されました(図8A)。続いて、TISIDBデータベースを用いてTMEM200A発現とTIL(腫瘍浸潤リンパ球)の相関を調べたところ、TMEM200A発現と28種類のがんにおけるTILの存在量との間に密接な相関関係があることが示されました(図8B)。TISIDBデータベースを用いて、ヒト悪性腫瘍におけるTMEM200A発現と免疫抑制薬の相関関係を評価し、免疫調節剤とTMEM200A発現の関係をより詳細に調べた。その結果、TMEM200A発現レベルは、さまざまながんの免疫抑制剤と有意に相関していることが示されました(図8C)。精巣腫瘍とUMでは、TMEM200A発現と特定の免疫抑制剤との間に有意な相関が認められました(図8D-F)。次に、TISIDBデータベースを用いて、免疫賦活因子およびMHC分子とのTMEM200A発現の相関解析を行いました(図8G、H)。その結果、膀胱尿路上皮がん、精巣がん、副腎皮質がん、UMにおいて、TMEM200A発現が選択された免疫賦活剤およびMHC分子と相関していることが示されました(図8I-L)。次のステップは、TISIDBデータベースのTCGA PanCanコホートにおけるTMEM200A発現と免疫学的または分子的サブタイプとの相関を調べることでした。その結果、BLCA、UVM、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、TGCT、BRCAなど、9種類のがんの免疫学的サブグループで発現TMEM200A異なることがわかった(図8M)。さらに、HNSC、KIRP、LIHC、PCPG、OV、LUSCなど、多様な分子サブグループを持つ6つの異なるがん形態で、TMEM200A発現にばらつきが見られました(図8N)。

TMEM200A および免疫療法反応解析
PD-1/PD-L1阻害薬の有効性はTMBと高い相関があり、一部の腫瘍患者は、免疫療法の有効性についてTMBマーカーを用いてある程度予測することができる34。マイクロサテライト不安定性(MSI)は、マイクロサテライトの複製ミスが修正されず蓄積され、マイクロサテライトの長さまたは塩基組成が変化する場合に、欠陥のあるDNAミスマッチ修復(MMR)機能を説明するために使用される用語である35。MSIは臨床的に重要な腫瘍マーカーである36。そこで、TMEM200A発現とTMBまたはMSIとの相関関係を調べることにより、免疫療法に対するTMEM200A発現の影響を評価しました。その結果、THYM、PRAD、OV、LAML、KIRP、およびKIRCでは、TMEM200A発現とTMBの間に実質的な正の相関が示されましたが、TMEM200A発現はUCEC、PAAD、LUSC、LUAD、LIHC、LGG、HNSC、GBM、およびBRCAと負の相関がありました(図9A)。MSIとTMEM200A発現はTGCTで強くかつ良好に関連していましたが、TMEM200A発現はUCEC、STAD、SKCM、LUSC、LUAD、HNSC、およびCHORでMSIと有意かつ負の相関がありました(図9B)。また、ICBの有効性を検討するためのバイオマーカーとしてのTMEM200Aの可能性を評価しました。結果は、TMEM200Aだけで、25のICB亜集団のうち7つで0.5>曲線下面積(AUC)の精度でICB反応を予測したことを示しました。 TMEM200Aは、T細胞クローンおよびB細胞クローンよりも高い予測値を示し、どちらも値が5でした。しかし、TMEM200Aの値は、TIDE(11のICB亜集団でAUC > 0.5)、MSIスコア(11のICB亜集団でAUC > 0.5)、CD274(15のICB亜集団でAUC > 0.5)、CD8(17のICB亜集団でAUC > 0.5)、IFNG(16のICB亜集団でAUC > 0.5)、およびMerck18(17のICB亜集団でAUC > 0.5)の値よりも低かった(図9C).ICB_Ria 2017_PD1 Ipi_Naïve、ICB_Gide 2019_PD1、およびICB_Hugo 2016_PD1コホートにおける生存予後不良は、高TMEM200A発現と相関していた。しかしTMEM200Aノックダウンにより、Kearney 2018 T_PD1およびPan 2018 OT1の平均コホートにおいて、リンパ球を介した腫瘍殺傷力が増強されました(図9D)。

異なるがんにおける TMEM200A のGSEA濃縮分析
32の悪性腫瘍において、高発現サブグループと低発現サブグループTMEM200A TMEM200A DEGを用いて、TMEM200A関連がんの特徴を調べた。原発性免疫不全症、RIG(レチノイン酸誘導遺伝子)-I様受容体シグナル伝達経路、および汎がん、特にBLCA、COAD、KICH、GBM、LUSC、LUAD、MESO、READ、SARC、およびSKCMにおけるTMEM200A発現との間に実質的な相関関係があることを発見しました(図10)。ウイルス細胞質タンパク質リボ核酸は、RIG−I様受容体シグナル伝達経路によって検出される。RIG-I様受容体は、特定の細胞内結合タンパク質に関与することにより、NF-κBシグナル伝達経路を活性化することにより、体内のさまざまな炎症性サイトカインの産生に影響を与える可能性があります。その結果、膜貫通タンパク質200A(TMEM200A)は、RIG−I様受容体による細胞内タンパク質の動員において重要な役割を果たす可能性がある。これらの発見は、TMEM200A発現と免疫学的浸潤の間に強い相関関係があることを示唆しました。さらに、GSEA濃縮解析により、汎がんTMEM200A発現は、ケモカインシグナル伝達、細胞接着、サイトカイン受容体結合、細胞膜感知経路、およびオートファジー制御と相関していることが示されました(図10)。膜貫通タンパク質は、カルシウムリザーバーからの細胞へのカルシウムイオンの侵入を制御する上で重要な役割を果たすことに加えて、腫瘍微小環境に影響を与える接着分子として機能し得る36。したがって、GSEA濃縮解析から得られた結果は、シグナル伝達経路の活性化、原形質膜イオンチャネルの形成、細胞走化性、接着、アポトーシス、オートファジーの調節など、多くの生理学的プロセスにTMEM200Aが関与していることによるものである可能性があります9。

STADで共発現したLinkedOmicsデータベースの TMEM200A と正および負の相関がある上位50のSTAD遺伝子をヒートマップの形で特定しました(図11A、B)。GCでは、上位5つの遺伝子を肯定的に評価し、上位5つの遺伝子を TMEM200A と負に関連させて評価しました(図11C)。その結果 、TMEM200A 発現はSPON1(r = 0.51)、CDH11(r = 0.50)、EPB41L2(r = 0.49)、LUM(r = 0.49)、SAMD3(r = 0.49)、OVOL2(r = -0.37)、RASAL1(r = -0.36)、IRX5(r = -0.35)、SLC4A11(r = -0.34)、およびSYTL1(r = -0.33)の共発現と相関していることが示されました。STADにおける TMEM200A の役割をさらに理解するために、閾値の可視化結果を分析しました。スクリーニングには、log2倍変化(FC)>2.0および調整 P 値0.05の基準が用いられた。その結果、483 の DEG が見つかり、そのうち 385 がアップレギュレーションされ、98 がダウンレギュレーションされ、そのうちの 100 を可視化してヒートマップを作成しました(図 11D)。次に、スクリーニング基準を満たすDEGについて、GOおよびKEGG濃縮分析を実施しました。GO濃縮解析の結果、BP(Biological Process)の濃縮は主に細胞外マトリックスと構造組織に関連し、CC(Cellular Component)の濃縮は主にコラーゲン含有細胞外マトリックスと基底膜に関連し、MF(Molecular Function)は主に細胞外マトリックス構造とグリコサミノグリカン結合に関連していることが示されました(図11E および 図11G)).KEGG解析の濃縮により、 TMEM200A は主に細胞外マトリックス受容体相互作用経路、シトクロムP450、およびレニン-アンジオテンシン系で濃縮されていることが示されました(図11F および 図11H)。

胃がんのTMEM200Aに基づく予後モデルと臨床的特徴
STAD患者の TMEM200A と臨床データの相関を調べ、ロジスティック回帰分析と TMEM200A 発現レベルに基づいて、TCGA-STADコホートの患者の臨床病理学的特徴を分析しました(図12A)。単変量Cox回帰分析によると、年齢、臨床病期、および TMEM200A 発現はすべて、STAD患者のOSと実質的に相関していた(図12B)。多変量Cox回帰分析により 、TMEM200A 発現がSTAD患者におけるOSの単独予測因子である可能性があることが示された(HR = 1.282、95%CI = 1.066-1.541、 P = 0.008)(図12C)。これらの臨床病理学的特徴が、STADで1年、3年、5年後のOSを予測する可能性を、いくつかの臨床パラメータと組み合わせて標準列線プロットモデルを用いて検討した(図12D)。1 年生存確率の検量線は、カラムラインプロットの予測確率と非常に一致していました(図 12E)。

STAD細胞におけるTMEM200Aアップレギュレーションと細胞増殖の亢進
TMEM200Aに関する文献をレビューした結果、TMEM200Aの高発現は予後不良を示し13、GC免疫微小環境は接着分子37として作用するTMEM200Aの影響を受け、GC細胞の浸潤と転移を促進する可能性があることを発見した。STAD細胞株のTMEM200Aタンパク質レベルとmRNA転写レベルを調べ、前述の研究結果を確認しました。GC細胞株HGC-27は、タンパク質およびmRNA転写産物レベルの両方で、健康な胃粘膜上皮細胞株GES-1と比較してTMEM200A劇的に過剰発現しており(図13A、B)、HGC-27細胞でTMEM200A過剰発現していることを示しています。その結果、HGC-27細胞を用いて以下の試験を実施した。一方、実験結果の正確性を証明するために、qRT-PCRを用いてヒトGC細胞SGC-7901と胃粘膜上皮細胞GES-1におけるTMEM200AのmRNA発現差を比較したところ、SGC-7901細胞ではTMEM200Aが高発現していることが分かりました(図13B)。TMEM200AをHGC-27細胞でノックダウンし、STADへのTMEM200A関与の可能性を調べました(図13C)。データベースマイニングの結果とTMEM200Aの相関解析から、TMEM200Aは主にがんの増殖や浸潤に関与する細胞外マトリックス受容体相互作用経路に関与していることがわかりました。そこで、CCK-8アッセイを用いて、TMEM200A発現が細胞増殖にどのような影響を与えるかを調べました。CCK-8アッセイでは、TMEM200Aノックダウン群(Si-RNA2およびSi-RNA3)は、NC群と比較して細胞生存率の著しい低下を示しました(図13D)。これらの知見は、TMEM200AがSTADでアップレギュレーションされており、その発現レベルがGC細胞の増殖に影響を与える可能性があることを示唆しています。図11FのKEGG濃縮解析の結果から、TMEM200AはGCにおけるPI3K/AKTシグナル伝達経路と関連しており、細胞接着因子としてのTMEM200AがEMTに影響を与えることで胃がんのメカニズムに影響を与える可能性があることを見出しました。そこで、ウェスタンブロッティングを用いて、TMEM200AノックダウンがEMTおよびノックダウン前後のPI3K/AKTシグナル伝達経路に及ぼす影響を検証しました。その結果、TMEM200Aノックダウン群(TMEM200A-SiRNA2)では、ネガティブコントロール群(NC)と比較してP-AKTタンパク質の発現が低下し、N-カドヘリン、ビメンチン、およびSnaiタンパク質のレベルも低下し、E-カドヘリンタンパク質の発現が増加したことが示されました(図13E)。これらの結果から、TMEM200AはPI3K/AKTシグナル伝達経路を介してEMTに影響を及ぼし、GCに関与している可能性が示唆されています。

図1:研究のワークフロー。 略語: TCGA = The Cancer Genome Atlas database;TIMER2.0 = TIMER2.0 データベース。OS =全生存期間;PFS = 無増悪生存時間;DSS = 疾患特異的生存期間;DFS = 無病生存期間;TMB = 腫瘍の突然変異の負荷;MSI = マイクロサテライト不安定性;PPI = タンパク質間相互作用;GGI = 遺伝子間相互作用;KEGG = 京都遺伝子ゲノム事典;GO = 遺伝子オントロジー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:さまざまながんにおける TMEM200A の発現レベル。 (A)さまざまなヒト悪性腫瘍におけるTCGAデータセットからの TMEM200A の発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション。(B)TIMER2.0データベースを用いた腫瘍および正常組織における TMEM200A 発現レベルの分析。(C)TCGAデータセットからの種々のヒトがんにおける TMEM200A 遺伝子活性の差動解析。(D)ssGSEAスコアリングに基づくさまざまなヒト癌における TMEM200A の遺伝子活性レベルのランキング。(E)健康な組織におけるHPAデータベースからの TMEM200A 発現レベル。(F)正常細胞株におけるHPAデータベースの TMEM200A 発現レベル。(G)HPAデータベースからのがんにおける TMEM200A タンパク質発現に関するIHCアウトカム。略語:TCGA = The Cancer Genome Atlas;ssGSEA = 単一サンプル遺伝子セット濃縮分析;HPA = ヒトタンパク質アトラス;IHC = 免疫組織化学。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3: TMEM200A 発現と臨床病理学的特徴およびさまざまな腫瘍の予後との相関 。 (A)TCGA汎がん(PanCan)コホートにおける TMEM200A 発現と各腫瘍における臨床病理学的病期分類との相関を、UCSC Xenaデータベースを用いて解析した。(B)TCGA PANCANコホートにおける TMEM200A 発現と各腫瘍の患者の年齢との相関。(C)TCGA PANCANコホートにおける TMEM200A 発現と各腫瘍の腫瘍病理学的悪性度との相関。(D)TCGA PanCanコホートにおける TMEM200A 発現と各腫瘍の患者の生存状態との相関。(E)Cox回帰モデルを用いた各種がんにおける TMEM200A 発現と汎がん全生存率の相関分析。(F)TCGA PanCanコホートにおける TMEM200A 発現と汎がんOS予後の相関。(G) TMEM200A 発現と疾患特異的生存率の相関。(H)TCGA PanCanコホートにおける TMEM200A 発現と無増悪間隔予後の相関。(I) TMEM200A 発現と無病期間の相関。(J)KIRCについて多因子COX回帰分析を行った。(K)KIRPで多因子COX回帰分析を行った。略語:TCGA = The Cancer Genome Atlas;KIRC:腎臓腎明細胞癌;KIRP:腎腎乳頭細胞癌;OS = 全生存期間;DSS = 疾患特異的生存期間;PFI = 無増悪間隔;DFI = 無病間隔。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:さまざまながんにおける TMEM200A のDNAメチル化分析。 (A) SMART データベースによると、TMEM200Aのプロモーターメチル化レベルがいくつかのがんタイプで調べられました。(B)正常組織よりも異なる種類の 癌におけるTMEM200A のプロモーターメチル化レベルがUALCANデータベースに従って調べられました。 (C)UALCANデータベースを用いて、いくつかのがん種において、正常組織ではプロモーターメチル化レベルの TMEM200A が低いことが決定された。(エ)BLCA、HNSC、LUAD、およびSTADにおける TMEM200A のDNAメチル化レベルは、病理学的段階とともに変化しました。略語:BLCA=膀胱尿路上皮癌;HNSC= 頭頸部扁平上皮癌;LUAD=肺腺癌;STAD =胃腺癌。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:さまざまながんにおける TMEM200A 遺伝子変異。 (A)cBioPortalデータベースを用いた異なるがんにおける TMEM200A 遺伝子変異型の解析。(B) TMEM200Aの3Dタンパク質構造。結合領域は色付きの部分で示され、 TMEM200A の他の部分は灰色の部分で示されます。(C)アイソフォームと TMEM200A 体細胞変異の分布。 X軸、アミノ酸部位; y軸、 TMEM200A 変異の数。緑の点、ミスセンス突然変異。灰色の点、切り捨てられた突然変異。(D)Sangerbox 3.0のデータを使用したアイソフォームの検証と TMEM200A 体細胞変異の分布。(E)すべてのTCGA腫瘍について、cBioPortalデータベースを用いて、変異状態と患者の全生存予測との相関を調べ、赤色の四角形は TMEM200A 変異群、青色の四角形は変異のない群を示した。(F) TMEM200A と共変異した遺伝子をcBioPortalツールを用いて解析した:TP53、AKAP7、TAAR5、TAAR1、MOXD1、THEMIS、VNN2、ENPP3、TMEM244、SLC18B1。(G) COSMICデータベースを用いたGCにおける TMEM200A 変異型の解析(H)GCにおける TMEM200A SNV型の解析は、COSMICデータベースを用いて行った。略語:TCGA = The Cancer Genome Atlas;OS = 全生存期間;COSMIC = がん細胞の体細胞変異のカタログ;GC = 胃がん。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:異なるがんにおける TMEM200A 発現の単一細胞相関解析。 (A)TISCHウェブサイトにおける TMEM200A 発現の要約。(B)転移性皮膚黒色腫GSE72056データセットにおける8つの異なる細胞型の分布。(C)GSE72056データセットからの皮膚転移性黒色腫細胞における TMEM200A の発現レベル。(D)GSE146771の大腸がんデータセットにおける13種類の異なる細胞の分布。(E) GSE146771 データセットからの大腸癌細胞の発現レベルTMEM200A。(F) TMEM200A 発現と多発性腫瘍における単一細胞の機能状態との相関関係を、CancerSEAデータベースを用いて実証した。(G)GBM、LUAD、CML、CRC、RB、およびUMを含む個々の腫瘍細胞における TMEM200A 発現レベルを示すT-SNEマップ。略語:GBM =神経膠芽腫;LUAD = 肺腺癌;CML = 慢性顆粒球性白血病;CRC = 大腸がん;RB = 網膜芽細胞腫;UM = ぶどう膜黒色腫。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:遺伝子レベルでの TMEM200A の共発現ネットワークと機能エンリッチメント解析。 (A) TMEM200A とその共発現遺伝子のGGIネットワーク。(B)PPIネットワーク。(C、D) TMEM200A および共発現遺伝子を解析し、GOおよびKEGG経路の濃縮について調べました。略語:PPI =タンパク質間相互作用;GGI = 遺伝子間相互作用;KEGG = 京都遺伝子ゲノム事典;GO = 遺伝子オントロジー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図8:さまざまな種類のがんにおけるTMEM200Aと免疫細胞、免疫抑制剤、免疫賦活物質、およびMHC分子の発現の相関関係。 (A)TMEM200A発現と免疫浸潤細胞の相関関係を示すSangerbox 3.0ヒートマップ。(B)TISIDBデータベースにおける免疫浸潤細胞とTMEM200A発現の相関関係を示すヒートマップ。(C)TISIDBデータベースにおける免疫抑制細胞とTMEM200A発現の相関関係を示すヒートマップ。(D-F)精巣腫瘍およびブドウ膜黒色腫におけるTMEM200A発現と特定の免疫抑制剤との相関。(G)TISIDBデータベースにおける免疫賦活因子とTMEM200A発現との相関関係を示すヒートマップ。(H)TISIDBデータベースにおけるTMEM200A発現とMHC分子の相関関係のヒートマップ。(I-L)膀胱の尿路上皮癌、精巣癌、副腎皮質癌、およびブドウ膜黒色腫におけるTMEM200A発現といくつかの免疫賦活因子およびMHC分子との相関。(M)汎がん免疫サブグループとTMEM200A発現の相関。(N)汎がん分子サブグループとTMEM200A発現の相関。略語: MHC = Major histocompatibility complex.この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図9:汎血球減少症における TMEM200A の免疫療法反応の分析。 (A)異なる癌における TMEM200A 発現とTMBの相関。(B)汎がんにおけるMSIと TMEM200A 発現の相関。(ハ) TMEM200Aは、免疫チェックポイント遮断応答を予測するためのバイオマーカーとしての可能性を秘めています。(D) TMEM200AとICB生存率の相関の加重平均およびCRISPRスクリーニングにおける対数倍変化(logFC)を用いてランク付けした。略語:TMB = Tumor mutational burden;ICB = 免疫チェックポイント遮断;CRISPR = Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図10:さまざまながんにおけるTMEM200AのGSEA濃縮分析。TMEM200Aが32のがんの調節に主要な機能的役割を果たした上位5つの経路が、GSEA濃縮分析によって同定された。左のパネルは、ACC、BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、MESO、OV、PAAD、PCPG、PRAD、READ、および SARC の TMEM200A の GSEA エンリッチメント分析の結果を示しています。右のパネルは、SKCM、STAD、TGCT、THCA、THYM、UCEC、UCS、UVM のTMEM200Aの GSEA 濃縮分析の結果を示しています。略語: GSEA =Gene Set Enrichment Analysis;ACC = 副腎皮質癌;BLCA = 膀胱尿路上皮癌;BRCA = 乳房浸潤性癌;CESC = 子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌;CHOL = 胆管癌;COAD = 結腸腺癌;ESCA = 食道癌;GBM = 多形性神経膠芽腫;HNSC = 頭頸部扁平上皮癌;KICH = 腎臓の発色恐怖症;KIRC = 腎臓腎明細胞癌;KIRP = 腎臓腎乳頭細胞癌;LAML = 急性骨髄性白血病;LGG = 脳低悪性度神経膠腫;LIHC = 肝細胞癌;LUAD = 肺腺癌;LUSC = 肺扁平上皮癌;MESO = 中皮腫;OV = 卵巣漿液性嚢胞腺癌;PAAD =膵臓腺癌;PCPG = 褐色細胞腫および傍神経節腫;PRAD = 前立腺腺癌;読む 直腸腺癌;SARC=肉腫;SKCM = 皮膚黒色腫;STAD =胃腺癌;TGCT = 精巣胚細胞腫瘍;THCA = 甲状腺がん;THYM = 胸腺腫;UCEC = 子宮体子宮内膜癌;UCS = 子宮がん肉腫;UVM = ぶどう膜黒色腫。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図11:STADのTMEM200A。 (A)LinkedOmicsデータベースによってSTADのTMEM200A発現と負の相関があることが判明した上位50の遺伝子。(B)TMEM200Aと正の関連を示したSTADの上位50個の遺伝子。(C)TMEM200AのSTADにおける正の相関遺伝子の上位5つと負の相関遺伝子5つ。(D)STADのDEGのヒートマップ。(E-H)スクリーニングされたDEGを使用した濃縮GOおよびKEGG経路の調査。略語:STAD =胃腺癌;DEGs =遺伝子の差次的発現;KEGG = 京都遺伝子ゲノム事典;GO = 遺伝子オントロジー。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図12:STADの臨床的特徴と TMEM200A 発現レベルの相関関係。 (A)ロジスティック回帰を用いた TMEM200A 発現レベルとSTAD臨床特性の分析。(B、C)単一変数と複数変数のSTADフォレストプロットのCox分析。(D)性別、病理学的悪性度、年齢、病理学的病期、および TMEM200A 発現に基づいてSTAD患者のOSを予測する列折れ線グラフ。(E)縦棒グラフモデルのキャリブレーションを示すキャリブレーションプロット。略語:STAD =胃腺癌;OS=全生存期間。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図13: TMEM200A 発現はSTADでアップレギュレーションされ、胃がん細胞の増殖を促進します。 (A)ウェスタンブロッティングによる胃癌細胞HGC-27および胃粘膜上皮細胞GES-1における TMEM200A 発現の検出。(B)GC細胞HGC-27およびSGC-7901、および胃粘膜上皮細胞GES-1における TMEM200A 発現のqRT-PCRによる検出。(C) TMEM200A の発現効率は、qRT-PCRで実証されたように、GC細胞HGC-27の非ノックダウン群と比較して、 TMEM200A ノックダウン群で大幅に低下しました。(D) TMEM200A ノックダウンは、CCK8アッセイによって測定されたGC細胞の増殖を有意に阻害した。(E) TMEM200A のノックダウンは、EMTの関連タンパク質を有意に阻害し、PI3K/AKTシグナル伝達経路におけるAKTのリン酸化に影響を与えた。略語:GC =胃がん;qRT-PCR:定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;EMT=上皮間葉転換;AKT=プロテインキナーゼB。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者らは、利益相反はないと宣言しています。