概要

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

Published: November 21, 2023
doi:

概要

このプロトコルはマウスの肺静脈の顕微鏡検査導かれた隔離そしてimmunofluorescenceの汚損を示す。左心房、肺静脈、および対応する肺を含む組織サンプルを調製し、心臓トロポニンTおよびコネキシン43について染色します。

Abstract

肺静脈(PV)は、心房性不整脈における異所性拍動の主要な原因であり、心房細動(AF)の発症と進行に重要な役割を果たします。PVには、心筋細胞で構成される心筋スリーブ(MS)が含まれています。MSは、異所性電気インパルスを生成する能力など、心臓の働く心筋との類似性を維持するため、AFの開始と維持に関与しています。げっ歯類は広く使用されており、心筋細胞は血管壁全体に広く存在するため、肺静脈心筋を研究するための優れた動物モデルを表す可能性があります。しかし、マウスPVの正確なマイクロダイセクションと調製は、臓器のサイズが小さく、解剖学的構造が複雑なため、困難です。

マウスの左心房(LA)をPVとともに単離するための顕微鏡ガイド下顕微解剖プロトコルを実証します。 心臓トロポニン-T(cTNT)およびコネキシン43(Cx43)抗体を使用して免疫蛍光染色を行い、LAとPVの全長を可視化します。10倍および40倍の倍率でのイメージングは、PV構造の包括的なビューと心筋構造への詳細な洞察を提供し、特にMS内のコネキシン43の存在を強調しています。

Introduction

心房細動(AF)は、最も一般的な持続性不整脈です1。心房細動の有病率はさらに増加しており、2060年にはヨーロッパで~1,790万人の患者数が見込まれています1。心房細動は、心筋梗塞、心不全、脳卒中の発症に不可欠な危険因子であり、個人的、社会的、社会経済的に多大な負担をもたらすため、臨床的に非常に重要です1。心房細動は何十年も前から知られていますが、心房細動の病態生理学はまだ完全には理解されていません2

すでに1990年代後半には、肺静脈(PV)が心房細動を誘発する異所性拍動の主な発生源であるため、心房細動の開始と維持に大きな影響を与えることが研究で実証されています3。PVは他の血管とは構造的に異なることが実証されています。一般的な血管には平滑筋細胞が含まれていますが、PVのチュニカ培地には心筋細胞も含まれています4。げっ歯類では、この心臓の筋肉組織は、肺内および肺外部分、ならびに開口部領域を含むPV全体に遍在する5。ヒトでは、PVには心筋細胞も含まれており、左心房(LA)の心筋、いわゆる心筋スリーブ(MS)の延長部内で観察することができます6,7

多発性硬化症は心房心筋形態学的に類似している8。心房とPV心筋細胞の形状とサイズは互いに有意に変化せず、同等の電気生理学的特性を示します8。PV内の電気生理学的記録はMSの電気的活動を証明し、血管造影画像は心拍と同期した収縮を明らかにしました9,10

ギャップ結合は、6つのコネキシンサブユニットからなる細孔形成タンパク質複合体であり、イオンと低分子の通過を可能にする11。ギャップ結合は細胞間アポジションに存在し、隣接する心筋細胞を相互接続し、心筋細胞間の細胞間電気的結合を可能にする12,13。いくつかのコネキシンアイソフォームが心臓で発現しており、コネキシン43(Cx43)は心臓のすべての領域で発現する最も一般的なアイソフォームである14。以前の研究は、PVの心筋細胞におけるCx43の発現の証拠を提供します15,16

インタクトPV内のMSは、そのデリケートな構造のため、特に小動物モデルでは依然として困難です。ここでは、顕微鏡ガイド下マイクロダイセクションを使用して、マウスのLAおよび肺葉とともにPVを同定および分離する方法を示します。さらに、PVの免疫蛍光染色を実証し、PV内の心筋細胞とその相互接続を可視化します。

Protocol

動物の飼育とすべての実験手順は、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学の動物管理および倫理委員会のガイドラインに従って実施され、マウスを使用したすべての手順は、Regierung von Oberbayern(ROB 55.2-2532)によって承認されました。Vet_02-20-215、ロブ55.2-2532。Vet_02-18-46、ロブ55.2-2532。Vet_02-19-86、ROB 55.2-2532。Vet_02-21-178、ロブ55.2-2532。Vet_02-22-170)です。C57BL6/Nマウスを市販した。 <p clas…

Representative Results

12-16週齢のマウス10匹でPVのマイクロダイセクション、染色、イメージングを行いました。プロトコールに従って、すべての実験マウスでLAとともにPVをマイクロダイクすることに成功し、8匹のマウスでPVを包括的に把握した切片を取得しました。LA-PV接合部のPVオリフィス(PVO)領域、肺外PV(PV ex)(肺門とLA-PV接合部の間のPV)、肺内PV(PVin)(肺組織に囲まれたPV)を特定するために、10倍…

Discussion

このプロトコルでは、マウス心臓のPVを区別して単離し、免疫蛍光染色を行う方法を共有しています。臓器摘出後、心臓と肺を滅菌したスクロース溶液で脱水し、続いて顕微鏡ガイド下で心室を心房と肺葉から分離しました。その後、心臓ベースを準備してPVを視覚化し、肺門からPVを切除しました。その後の免疫蛍光染色は、組織をO.C.T.化合物に包埋し、クライオトームで切断し、cTNTとCx43?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.)、China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.)、German Research Foundation (DFG;血管医学の臨床医科学者プログラム(PRIME)、MA 2186 / 14-1からPT)、およびコロナ財団(S199 / 10079 / 2019からSC)。

Materials

Adhesion slides Epredia 10149870
AF568-secondary antibody Invitrogen A11036 Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose Biozym LE 840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody Cell Signaling Technology 4408S Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody Abcam ab11370 Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit 
Anti-cTNT antibody Invitrogen MA5-12960 Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Brush Lukas  5486 size 6
Cover slips Epredia 24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70 Epredia  Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera Leica 
DM6 B fluorescence microscope Leica 
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. Gibco 14040133 500 mL
Dumont #5FS Forceps F.S.T. 91150-20 2 pieces needed
Fine Scissors F.S.T. 14090-09
Fluorescence mounting medium DAKO S3023
Graefe Forceps F.S.T. 11052-10
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Cell nuclei counterstaining
ImageJ FIJI analysis and processing software
LAS X Leica  Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35 Feather 207500000
Microwave
Normal goat serum Sigma-Aldrich S26-M
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583
Paraformaldehyde 16% Pierce 28908 methanol-free
Pasteur pipettes VWR 612-1681
Petri dish TPP 93100 100 mm diameter
Rocker 3D digital IKA Schüttler 00040010000
Slide staining jars EasyDip M900-12
Specimen Molds Tissue-Tek Cryomold 4557 25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system StainTray 631-1923 Staining system for 20 slides
Sterican Needle Braun 4657705 G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors F.S.T. 91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker Super PAP Pen N71310-N
Syringes Braun 4606108V 10 mL
Tris base Roche TRIS-RO component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287

参考文献

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記事を引用
Villgrater, H. E., Xia, R., Sharma Chivukula, A., Tomsits, P., Clauss, S. Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins. J. Vis. Exp. (201), e65836, doi:10.3791/65836 (2023).

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