口腔顔面筋線維症モデルを確立するためのマウス咬筋の凍結損傷

口腔顔面筋は、咀嚼、発話、呼吸、表情などの日常的な生理活動において重要です¹。しかし、先天性口腔顔面奇形では、これらの筋肉は萎縮性および線維性の変化を示し、身体の健康と社会的認知の障害につながります²。顔面再建手術は依然として第一選択治療ですが、術後患者の最大30〜70%が依然として筋肉の喪失と筋肉機能障害に苦しんでいます^3,4 口腔顔面筋の再生の失敗は、手術だけでは修正できない内因性要因に起因しています。

口腔顔面筋の出現は進化的な新規性であり、複雑な脊椎動物の頭部と心室^5,6を伴います。体節由来の四肢とは異なり、口腔顔面筋は分枝弓⁷に由来します。これらの系統発生的および個体発生的な特徴は、彼らを明確な再生行動の素因となる可能性があります⁸。咬筋(MAS)は、前脛骨筋(TA)が同程度の損傷にさらされた後に完全に再生した時点で、重度の線維化を発症したことが報告されています^1,9。しかし、再生の根本的なメカニズムは、まだ十分に理解されていません。

本研究では、口腔顔面筋の再生に関する検討を容易にするために、マウスの咬筋の凍結損傷モデルを確立した。線維症の表現型を評価するための時点として、損傷後14日を選択しました。これは、2つの筋肉間で識別可能な分岐が検出可能な最も早い時点であったためです。損傷後のMASの完全な再生には、少なくとも40週間が必要です¹。一貫して、この研究では、損傷後14日でのTAの通常の再生と比較して、MASの凍結損傷後のコラーゲンの顕著な沈着が明らかになりました。このモデルの助けを借りて、筋萎縮と線維症のさらなる機構研究を行うことができ、その結果、手術後の口腔顔面筋の再生を促進するための潜在的な治療法の開発に役立ちます。

この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会(WCHSIRB-D-2020-114)によってレビューされ、承認されました。雄のC57BL/6マウス(5週齢)を、湿度制御(53±2%)および温度制御(23±2°C)の施設で飼育し、12時間の明暗サイクルで飼育しました。このプロトコールで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1.凍結傷害

1. 麻酔:イソフルランに浸した綿球でマウスを鎮静させ、チレタミン-ゾラゼパムを50 mg / kgの用量で腹腔内に注射します。.術前および術後の鎮痛は、1 mg / kgの投与量でメロキシカムの腹腔内注射によって提供されました。.獣医軟膏で目を保護してください。手術の全手順では、38°Cに保たれた加熱パッドを手術用ドレープの下に置いて、動物に熱サポートを提供しました。マウスを手術台に横向きに置いた後、粘着テープで固定します(図1)。まぶた反射、立ち直り反射、およびペダル離脱反射の喪失により、麻酔の十分性を評価します。
   注:イソフルオラン麻酔を適用するときは、マウスを片手で持ち、イソフルオランに浸したコットンボールを別の手で持ちます。.不快感や皮膚の炎症を避けるために、コットンボールを動物から離してください。
2. 術前の脱毛:電気カミソリを使用してマウスのふくらはぎと顔の毛を剃り、綿棒で脱毛ペーストを皮膚に塗布し、咬筋と前脛骨筋を覆います。1〜2分後、エタノールベースの外科用ワイプ(図2A および 図2G)でペーストを洗い流します。手術部位は、ヨウ素ベースのスクラブと75%エタノールを3ラウンド使用して消毒しました。
   注:電気カミソリだけでは、特に咬筋部分の脱毛には不十分でした。脱毛ペーストを塗布するときは、ペーストを過度に使用しないことが重要です。ペーストを洗い流すときは、皮膚の火傷を防ぐために皮膚をやさしく拭いてください。
3. 手術場への曝露:手術前に手術用ドレープで覆ってください。MAS筋の場合、最初に下顎骨の下縁に沿って触診します。端から5 mmのところで、口腔交連と耳珠を結ぶ線に沿って7 mmの切開を行います( 図2Bの破線は切開の位置を示しています)。
4. TA筋の場合、最初にふくらはぎに沿って触診して、脛骨の前縁を見つけます。膝から足首まで、メスで皮膚の端から2 mm後方に切り込みます(破線は 図2Hの切開部の位置を示しています)。各マウスについて、左側のMASとTA筋が損傷している場合は、反対側のもう一方の筋肉をコントロールとして使用します。
   注:このカットは、切開中に筋肉が損傷しないようにするための非常に表面的なものです。顔の切開部は耳珠に近すぎてはいけません。そうしないと、耳下腺が露出し、次の凍結プロセス中に過度の出血を引き起こします。
5. ドライアイス凍結:MAS筋とTA筋の長軸に沿って、予冷された鉗子でドライアイスを1つ保持します(それぞれ図2C と 図2I)。ドライアイスを筋肉の表面に直接5秒間置きます。ドライアイスを取り除いた直後は筋肉が硬く淡白に見えることを確認しますが(図2D および 図2J)、隣接する損傷していない筋肉と同様に、22〜25秒以内に通常の色と質感に戻ることを確認します(図2E および 図2K)。
   注意: ドライアイスを保持している鉗子は、ドライアイスの急激な昇華を避けるために予冷する必要があります。タイマーは、5秒の凍結損傷を実施し、筋肉の22〜25秒の回復時間を数えるために必須です。回復時間が22秒より短い、または25秒より長い筋肉は放棄する必要があります。この手順には練習が必要です。
6. 創傷閉鎖:筋肉が完全に回復した後、少なくとも3つの7-0縫合糸(図2F および 図2L)で皮膚創傷を閉じます。
7. 蘇生:縫合が完了したら、マウスを温支持付きのケージに入れ、すべての立ち直反射が回復するまでマウスを継続的に監視します。

2.マッスルコレクション

1. イソフルランの過剰摂取でマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行います。組織学的分析のために、両側のMAS筋とTA筋を採取します。
2. MAS筋解剖:マウスの顔の皮膚を切り開き、耳下腺を切除してMAS筋の後部を露出させます。MASを前部の付着部から下顎骨の後部の付着部まで解剖します。白い点線の領域は、MASの露出部分を示しています(図3A)。
   注:MAS筋は、下顎骨の表面に密接に付着した深いコンパートメントと表在するコンパートメントで構成されています。解剖中は、MASを完全に分離するために、はさみを下顎骨に押し付けてください。頬骨-下顎筋とMASを区別するには、頬骨と下顎骨の間の境界に注意してください。
3. TA筋肉解剖:足首から膝までの皮膚を切り開き、筋膜を切除してTA筋肉を露出させます。マイクロ解剖鉗子の先端を使用してTAの腱を分離し、膝までスライドさせて脛骨に付着している繊維を切断します。次に、足首の腱を切断します(図3B)。
   注:TA筋の場合、マウスの足首の周りにいくつかの筋腱があります。TAの腱、つまり脛骨に最も大きく、最も近い腱を見極めるには練習が必要です。
4. 予冷イソペンタン:2つの断熱バレルを準備します。小さな樽にイソペンタンを、大きな樽に液体窒素を入れます。筋肉解剖の10分前に、小さなバレルを大きなバレルの中に置きます(図3D)。
5. 埋め込み金型の準備:サンプルごとに円筒形の錫箔型を作成し、最適な切断温度(OCT)コンパウンドを充填します。
6. 新鮮凍結:筋肉をOCTに沈め、OCTコンパウンドに対して垂直に保持します(図3C)。ニードルホルダーを使用して、金型を事前に冷却したイソペンタンに移します。OCTが白く点灯するまで40秒待ちます(図3D)。
   注意: 金型の位置が低すぎないことを確認してください。そうしないと、イソペンタンがOCTと混合し、筋肉の凍結プロセスが損なわれます。金型内のOCTのレベルは、筋肉サンプルの高さに匹敵する必要があります。OCTの過剰摂取は避け、迅速かつ効率的に凍結してください。
7. サンプルの保管:新鮮な凍結筋肉サンプルは、明確にラベル付けされた24ウェルプレートで保存します。サンプルはすぐに切片化するか、長期間使用するために-80°Cで保存してください。

3. 組織学的解析

1. クライオスタットを使用して、筋肉サンプルから厚さ10 μmの切片を表面処理されたスライドに切断します。
2. スライドを氷冷アセトンに20分間入れ、ドラフトで20分間風乾します。
3. スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3 x 5分間洗浄します。
   注:このステップ以降、スライドは乾燥を避けるために湿度チャンバーに保管されました。
4. シリウスレッド染色
   1. 0.5 gのSirius Red粉末を500 mLの飽和ピクリン酸に溶解して、Sirius Red作業溶液を調製します。
   2. スライドをシリウスレッドワーキング溶液で室温で1時間染色します。
   3. スライドを0.5%酢酸で2 x 5分間洗浄します。
   4. 染色プロセス後、サンプルは最初に95%エタノールで15秒間脱水し、続いて無水エタノールで1分間脱水する必要があります。最後のステップでは、スライドを中性バルサムで取り付けます。
5. 免疫組織学的染色
   1. 0.3% Triton in PBSで切片を室温で20分間透過処理した後、PBS洗浄を行います。
   2. Pax7染色の場合は、参照されたキットに付属の試薬で切片をブロックします。ラミニンおよびPdgfrα染色の場合は、5%ウシ血清アルブミン(BSA)および5%ロバ血清をPBS中で室温で1時間ブロックします。
   3. Pax7、ラミニン、およびPdgfrαに対する一次抗体と切片を4°Cで一晩インキュベートした後、PBSで3 x 5分間洗浄します。
   4. 切片を蛍光色素標識二次抗体と室温で1時間インキュベートした後、PBSで3×5分間洗浄します。
   5. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)と室温で3分間インキュベートした後、PBSで3 x 5分間洗浄します。
   6. 封入部に封入剤をセットし、カバーガラスを上に置き、マニキュアでカバーシートをシールします。

HEとシリウスレッド染色(図4および補足図S1)により、この凍結損傷モデルでTAの完全な筋肉再生が明らかになりました。対照的に、MASは筋線維再生の障害と過剰な細胞外マトリックス沈着を示しました。無傷のMAS筋とTA筋の組織型を図4A、Bに示します。ここでは、筋線維が整列しており、線維化領域は間質性空間と異なる束の間にのみ現れます。TA筋は、損傷後14日で無傷のコントロールとほぼ同じ筋肉構造を維持していましたが(図4G-J)、MAS筋の構造はひどく乱れていました(図4C-F)。線維化領域は、MAS筋の前方、中央、および後方の断面のほぼすべての筋線維の代わりに現れました(図4C-F)。

Pax7(補足図S2)およびPdgfrαの免疫組織学的染色は、それぞれ筋衛星細胞(MuSC)および線維脂肪形成前駆細胞(FAP)のさらなる研究を促進しました。MAS筋では、14 dpiで、密集した核が現れましたが、それに比例してMuSCは増加しませんでした(図5A、B)。14 dpiのTAでは、中央に核を形成した筋線維(青い矢印で示す)が多数検出されましたが(図5H)、MASの損傷領域では筋線維の輪郭はほとんど目立ちませんでした(図5E、F)。その代わりに、Pdgfrα陽性FAPsの浸潤と新たに形成された小径筋線維(白矢印で示す部分)が観察されました(図5F)。

図1:手術セットアップの概要(A)マウスを麻酔し、手術台に固定した。左側の顔と脚から髪の毛が取り除かれました。タイマーを使用して、筋肉の凍結と回復時間を監視しました。(B)直径3.5mm、高さ6〜12mmのドライアイスをガラスビーカーに調製して冷凍した。鉗子は、後で使用するためにドライアイスで予め冷やされました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:MASおよびTA凍結損傷の術中記録(A)MAS凍結のための脱毛。(B)皮膚を開いてMAS筋肉を露出させます。(C)MASの長軸に沿ってドライアイスで凍結します。(D)凍結の5秒直後のMASの出現。(E)回復の22-25秒後のMASの出現。(F)顔面創傷閉鎖。(G)TA凍結のための脱毛。(H)皮膚を開いてTA筋を露出させます。(I)TAの長軸に沿ってドライアイスを使用して凍結します。(J)凍結の5秒直後のTAの出現。(K)回復の22-25秒後のTAの出現。(L)脚の傷口の閉鎖。略語:MAS =咬筋;TA = 前脛骨筋。図2Bおよび図2Hの破線は、切開部の位置を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:MASおよびTA筋肉の採取(A)凍結損傷後14日目のMAS筋肉の出現。赤い破線の楕円はMASを示します。白い破線の三角形はMAS筋の露出を示しています。(B)凍結損傷後14日でのTA筋の出現。赤い破線の楕円はTAを示します。(C)筋肉サンプルをOCTコンパウンドに垂直に沈めます。(D)筋肉サンプルを窒素冷却イソペンタンに移します。略語:MAS =咬筋;TA = 前脛骨筋;OCT = 最適な切断温度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:MASおよびTA筋の組織学的解析。シリウスレッド染色の無傷(A-E)MASの無傷の筋肉切片とMASの前部、中部、後部切片の14dpi。(F-J)TAの無傷の筋肉セクションとTAの前部、中央部、および後部セクションは14dpiです。スケールバー = 100 μm。略語:MAS =咬筋;TA = 前脛骨筋;DPI = 損傷後の日数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:MASおよびTA筋の免疫蛍光分析。 (A)インタクトMAS、(B)14 dpi MAS、(C)インタクトTA、および(D)14 dpi TAでのPax7およびDAPI(青)の免疫染色。(E)インタクトMAS、(F)14 dpi MAS、(G)インタクトTA、(H)14 dpi TAにおけるラミニン、Pax7、DAPI(青)の免疫染色。スケールバー = 20 μm。略語:MAS =咬筋;TA = 前脛骨筋;dpi = 損傷後の日数;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。白矢印はMASの代表的な小径繊維を示しています。青色の点線と矢印は、TAの代表的な再生筋線維と中心核を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:筋肉再生中の持続性線維症。(A)凍結損傷によって誘発されるTAおよびMAS筋肉再生の概略図。(B-G)損傷後のさまざまな時点でのTAおよびMAS筋肉断面におけるヘマトキシリンおよびエオシン染色の代表的な画像。スケールバー = 100 μm。この図はCheng et al.8から転載しています。略語:MAS =咬筋;TA = 前脛骨筋;DPI = 損傷後の日数。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:筋形成過程の障害。 (A)TAおよびMAS筋におけるPax7(緑)およびDAPI(青)の免疫蛍光画像。(B)Pax7陽性/ DAPI核の割合の定量化。スケールバー = 100 μm * 無傷の筋肉コントロールとは大きく異なることを示します。#同じ時点で他の筋肉と大幅に異なることを示します。**p < 0.01、##p < 0.01。この図はCheng et al.8から転載しています。略語:MAS =咬筋;TA = 前脛骨筋;dpi = 損傷後の日数;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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