がんの患者由来オルガノイドモデルにおける薬物反応のための多重化生細胞イメージング(英語)
概要
患者由来の腫瘍オルガノイドは、基礎研究およびトランスレーショナル研究のための高度なモデルシステムです。この手法では、異なるオルガノイド表現型の同時速度論的評価のためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージングの使用について詳しく説明します。
Abstract
がんの患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、がん細胞株と比較してヒトの疾患をよりよく再現する多機能研究システムです。PDOモデルは、細胞外基底膜抽出物(BME)で患者の腫瘍細胞を培養し、それらを3次元ドームとしてプレーティングすることによって生成できます。しかし、単層培養における表現型アッセイ用に最適化された市販の試薬は、多くの場合、BMEに適合しません。本稿では、PDOモデルをプレーティングし、自動生細胞イメージングシステムを用いて薬物効果を評価する方法について説明する。さらに、速度論的測定と互換性のある蛍光色素を塗布して、細胞の健康状態とアポトーシスを同時に定量化します。イメージ キャプチャは、数日間にわたって一定の時間間隔で行われるようにカスタマイズできます。ユーザーは、個々のZ平面画像または複数の焦点面からの連続画像のZ投影で薬物効果を分析できます。 マスキングを使用して、PDO番号、面積、蛍光強度など、関心のある特定のパラメータが計算されます。細胞毒性物質が細胞の健康、アポトーシス、生存率に及ぼす影響を示す概念実証データを提供しています。この自動キネティックイメージングプラットフォームは、がんのPDOモデルにおける多様な治療効果を理解するために、他の表現型読み出しに拡張することができます。
Introduction
患者由来腫瘍オルガノイド(PDO)は、がんの発生と治療反応を研究するための堅牢なモデルシステムとして急速に浮上しています。PDOは、原発腫瘍の複雑なゲノムプロファイルと構造を再現する3次元(3D)細胞培養システムです1,2。不死化がん細胞株の従来の2次元(2D)培養とは異なり、PDOは腫瘍内の不均一性を捕捉して維持するため3,4、機構研究とトランスレーショナル研究の両方にとって貴重なツールとなります。PDOはますます普及しているモデルシステムになりつつありますが、PDO培養に適合する細胞効果の市販の試薬や分析法は限られています。
治療反応の微妙な変化を解析する頑健な方法がないため、臨床翻訳が妨げられています。3D培養におけるゴールドスタンダードの細胞健康試薬であるCellTiter-Glo 3Dは、細胞生存率の決定要因としてATPレベルを利用しています5,6。この試薬はエンドポイントアッセイに有用ですが、いくつかの注意点があり、最も顕著なのは、アッセイの完了後にサンプルを他の目的に使用できないことです。
生細胞イメージングは、蛍光試薬と組み合わせることで、アポトーシス7,8,9や細胞毒性10など、PDOモデル内のさまざまな細胞の健康状態を定量化できる高度な速度論顕微鏡です。実際、生細胞イメージングは、2Dプラットフォームにおける化合物のハイスループットスクリーニングに不可欠である11,12。Incucyteなどのシステムにより、この技術は手頃な価格になり、さまざまな環境で研究グループが利用できるようになりました。しかし、これらのシステムを3D培養の分析に応用することは、まだ初期段階にあります。
本稿では、マルチプレックス生細胞イメージングを用いて、がんのPDOモデルにおける薬物反応を評価する方法について述べる(図1)。明視野画像の解析により、PDOのサイズと形態の変化を動力学的に監視できます。さらに、アポトーシス用のAnnexin V Red Dyeや細胞毒性用のCytotox Green Dyeなどの蛍光試薬を使用して、細胞プロセスを経時的に同時に定量することができます。ここで紹介する方法は、Cytation 5生細胞イメージングシステム用に最適化されていますが、このプロトコルは、異なる生細胞イメージングプラットフォームに適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDO培養は、細胞の応答や挙動を反映する能力があるため、in vitroモデルシステムとしてますます人気が高まっています2。PDOの生成、培養、増殖技術は大きく進歩しましたが、治療反応を解析する方法は遅れていました。市販の3D生存率キットは溶解性エンドポイントアッセイであり、潜在的に貴重な速度論的反応データを見逃し、他の方法によるその後の?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
患者の腫瘍標本を提供してくれたアイオワ大学のTissue Procurement CoreとKristen Coleman博士、PDOモデルの生成を支援してくれた産婦人科のSofia Gabrilovich博士に感謝します。また、論文の批判的分析をしてくれたValerie Salvatico博士(Agilent、米国)にも感謝します。我々は、以下の資金源を認める:NIH/NCI CA263783及びDOD CDMRPはKWTにCA220729P1する。Cancer Research UK、Prostate Cancer UK、Prostate Cancer Foundation、Medical Research CouncilからJSdBへ。資金提供者は、実験の設計や分析、出版の決定に何の役割も果たしていなかった。
Materials
| 1.5 mL microcentrfuge tube | Dot Scientific Inc | 1008113 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.100 | |
| 554 NM LED Cube | Agilent | 1225012 | |
| 96-well plate | Corning Costar | 3596 | Prewarmed to 37 °C |
| 96-well plate | Agilent | 204626-100 | Prewarmed to 37 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media) |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634-010 | component of organoid culture media |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| BioTek BioSpa 8 Automated Incubator | Agilent | BIOSPAG-SN | Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10) |
| BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Agilent | CYT5PW-SN | Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08) |
| Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Systems | BME001-10 | |
| Daunorubicin HCl | Sigma-Aldrich | S3035 | Reconstituted in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Fisher | AM9260G | |
| Forskolin | Tocris | 1099 | Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media) |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein | Gibco | AF-100-15-1MG | Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human FGF-10 Recombinant Protein | Gibco | 100-26-1MG | Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human R-Spondin 1 Recombinant Protein | Gibco | 120-38-5UG | Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technologies | 7926 | Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Imaging Filter Cube- GFP | Agilent | 1225101 | |
| Imaging Filter Cube- TRITC | Agilent | 1225125 | |
| Imaging LED GFP/CFP | Agilent | 1225001 | |
| Incucyte Annexin V Red Dye | Sartorius | 4641 | Reconstituted in organoid culture media |
| Incucyte Cytotox Green Dye | Sartorius | 4633 | DMSO solution |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media) |
| Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution | Fisher-Scientific | 13366169 | Add 1:50 volume |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media) |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media) |
| Recombinant Human Heregulinβ-1 | Pepro Tech | 100-03 | Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Staurosporine solution from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | S6942 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| Y-27632, CAS 331752-47-7 | Sigma-Aldrich | 688000 | Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media) |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media) |
参考文献
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762 (2020).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488 (2022).
- Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
- Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434 (2022).
- Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
- Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
- Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901 (2021).
- Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
- Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
- Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377 (2023).
- Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682 (2021).
- Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59 (2022).
- Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
- Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).
