水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

単一の細菌株による根圏のコロニー形成を検出するための定量的および定性的な方法があります。定性的方法には、蛍光を構成的に発現する株を使用し、蛍光分布と強度を蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点装置^1,2で調べる必要があります。これらの戦略は、in situ³ で細菌のコロニー形成をよく反映できますが、定量化における従来のプレート計数方法ほど正確ではありません。また、顕微鏡下では部分的な根域しか表示できないという制限があるため、主観的な偏見の影響を受けることがあります。

ここでは、コロニーを形成した細菌細胞を収集し、プレート上の細菌CFUをカウントすることを含む定量的方法について説明します。この方法は、植物の根から取り除かれたコロニー化された株を数えることができ、根上のコロニー化された細菌の総数を計算することができる希釈とプレーティングに基づいています^4,5。

まず、 A. thaliana を水耕栽培条件で培養し、次いで細菌細胞を根圏に最終濃度0.01OD₆₀₀で接種した。感染した根組織は、接種後2日で採取され、滅菌水で洗浄されて、コロニー化されていない細菌細胞を除去した。さらに、根にコロニーを形成した細菌細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で希釈し、Luria-Bertani(LB)寒天培地に播種しました。37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントして標準化し、根にコロニーを形成した細菌細胞を決定しました。

この方法は、適用性が高く、再現性が高く、根圏細菌のコロニー形成を正確に測定するのに適しています。

1.無菌水耕栽培A.thaliana栽培

1. A. thalianaの苗を準備します。
   1. 2%(wt/vol)のスクロースと0.9%(wt/vol)の寒天を含む1/2MS培地(MurashigeおよびSkoog)からなる培養 A.thaliana 苗培地を調製します。
   2. 調製した滅菌培地を滅菌正方形のペトリ皿(13 cm x 13 cm)に注ぎ、固化させます。湿度を保つために風乾は避けてください。
   3. A. thalianaの種子を、1 mLの滅菌水で満たした2 mLの微量遠心チューブに4°Cで12時間以上浸漬し、次いで種子を1 mLの2%(vol/vol)NaClOで2分間滅菌します。
   4. 種子を滅菌水で6回完全に洗浄し、NaClO溶液を除去します。滅菌チップ1mLのMS寒天培地でペトリ皿に種をまきます。
   5. 通気性のある医療用テープでシャーレを密封し、軽いインキュベーターに垂直に置いて1週間成長させます。ライトインキュベーターの昼夜比を16時間/ 8時間に設定し、温度を23°C、湿度を40%〜60%に保ちます。
2. A.thalianaを移植します。
   1. 孔径40 μmの細胞染色剤に5 mmの穴を開け、滅菌します。
   2. 生後7日齢の A. thaliana 植物3本を細胞ストレーナーの穴に移植し、0.5%スクロースを含む3mLの滅菌液体1/2MS培地を含む6ウェルプレートに入れます。
   3. 6ウェルプレートを軽いインキュベーター(図1A)に入れ、10日間インキュベートします。

2.細菌の培養と接種

1. 接種用の細菌懸濁液を準備します。
   1. Bacillus velezensisの場合、細菌細胞を滅菌LB培地に接種し、OD₆₀₀が0.8〜1.2になるまで170rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。
   2. 6000 x g で2分間遠心分離して細菌細胞を回収し、PBSバッファー(2 mM KH₂PO₄、8 mM Na₂HPO₄、136 mM NaCl、2.6 mM KCl)に再懸濁します。遠心分離と再懸濁のステップを3回繰り返して、LB培地と細菌代謝物を除去します。
   3. 細菌細胞を新鮮な1/2 MS培地に最終濃度OD₆₀₀ 0.01で懸濁します。 A. thaliana の苗を育てる6ウェルプレートにバクテリア懸濁液を接種し、6ウェルプレートをライトインキュベーターに入れ、2日間培養します。

3. 根に定着した細菌の測定

1. 根組織を採取し、コロニーを形成した細胞をプレートします。
   注:すべてのステップは、ノトバイオティクス条件下で実行する必要があります
   1. 2 mLチューブの重量を量り、重量をW₀として記録します。
   2. 共培養した A.thaliana 根組織を収穫し、滅菌水で3回洗浄します。根を濾紙の上に置き、余分な水分を取り除きます。
   3. 計量した微量遠心チューブに根を入れ、チューブと一緒に根を計量し、_W1として記録します。
   4. 各チューブに1mLのPBSを加え、チューブを最大速度で8分間ボルテックスします。
   5. 回収した根コロニー形成細菌細胞で懸濁液を1 x ^10-1-1 x ^10-4に希釈します(細菌のコロニー形成能力に応じて)。希釈した細菌懸濁液をLB寒天培地を含むプレートに広げ、37°Cで10時間インキュベートします。
2. コロニーをカウントし、データを正規化します。
   1. LBプレート上の細菌コロニーを数えます。
   2. 対応する希釈率に従ってCFUを計算し、ルートフレッシュ重量(W_{1-W 0})でデータを正規化します。最終結果は、接種後2日目の根のグラム当たりのコロニー形成された細菌細胞の数を示しています(図1B)。

この方法で検出される細菌の定着能の精度を調べるために、Bacillus velezensis SQR9 WTと誘導型変異体Δ8mcpを別々にA. thaliana根圏に接種した。Δ8mcpは、化学受容器をコードする遺伝子をすべて欠いた変異体であり、コロニー形成が著しく減少しています6。我々は、本根コロニー形成アッセイにより、接種後2日目のコロニー形成を測定した。その結果、根のコロニー形成がΔ8mcpの有意な減少を示し、この条件と方法が細菌のコロニー形成を効果的に測定することを示しています(図1C)。

図1: A. thaliana の成長と Bacillus velezensis SQR9および Δ8mcpの根のコロニー形成。 (A)水耕栽培状態の細胞染色剤を使用して6ウェルプレートで成長する生後7日齢の A.thalianaの上面図。(B)生後7日齢の A.thalianaの側面図は、各ウェルに3本の苗を含む6ウェルプレートで成長しています。(C)B . velezensis 野生型SQR9および Δ8mcp のコロニー形成は、提示されたアッセイを使用して測定されました。6回の繰り返しが含まれ、データはSEM±平均として示 されています。

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