ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング
概要
このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。
Abstract
ゼブラフィッシュは、その驚くべき心臓再生能力で知られる興味深いモデル生物です。収縮する心臓を in vivo で研究することは、損傷に応答する構造的および機能的変化に関する洞察を得るために不可欠です。しかし、ゼブラフィッシュの心臓の高解像度・高速4次元画像(4D、3D空間+1D時間)画像を取得し、心臓の構造や収縮性を評価することは依然として困難です。これに関連して、社内のライトシート顕微鏡(LSM)とカスタマイズされた計算分析を使用して、これらの技術的制限を克服します。LSMシステムの構築、レトロスペクティブ同期、シングルセルトラッキング、およびユーザー指向の解析を含むこの戦略により、トランスジェニック Tg(myl7:nucGFP) ゼブラフィッシュ幼生の単一細胞分解能で心臓全体の微細構造と収縮機能を調べることができます。さらに、低分子化合物のマイクロインジェクションをさらに取り入れて、正確かつ制御された方法で心臓障害を誘発することができます。全体として、このフレームワークにより、心臓の形態形成と再生中の単一細胞レベルでの生理学的および病態生理学的変化、および局所力学を追跡できます。
Introduction
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、その光透過性、遺伝的トラクタビリティ、および再生能力により、心臓の発達、生理機能、および修復を研究するために広く使用されているモデル生物です1,2,3,4。心筋梗塞では、構造的および機能的な変化が心臓駆出と血行動態に影響を与えますが、技術的な制限により、高い時空間分解能で心臓再生中の動的プロセスを調査する能力が引き続き妨げられています。例えば、共焦点顕微鏡などの従来のイメージング法では、複数の心臓周期における動的変化を捉え、心収縮機能を評価するためのイメージング深度、時間分解能、または光毒性の点で限界があります5。
ライトシート顕微鏡は、心臓の心室と心房にレーザーを素早く照射することで、これらの問題にうまく対処し、時空間分解能を高め、光退色や光毒性の影響を無視できる詳細な画像を実現する最先端のイメージング法です6,7,8,9,10,11。
このプロトコルは、LSMシステムの構築、4D画像再構築、3D細胞追跡、および複数の心臓周期12の間に心臓全体の心筋細胞の動態をキャプチャおよび分析するためのインタラクティブな分析を含む包括的なイメージング戦略を導入します。カスタマイズされたイメージングシステムと計算方法論により、トランスジェニック Tg(myl7:nucGFP) ゼブラフィッシュ幼生の心筋の微細構造と収縮機能を単一細胞レベルで追跡できます。さらに、低分子化合物をマイクロインジェクションを用いて胚に送達し、薬物誘発性心障害とその後の再生を評価しました。このホリスティックな戦略は、心臓の発生と再生における心筋の構造的、機能的、機械的特性を単一細胞レベルでin vivo で調査するためのエントリーポイントを提供します。
Protocol
この研究の承認は、テキサス大学ダラス校の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって、プロトコル番号 #20-07 の下で付与されました。本研究では、 Tg(myl7:nucGFP) トランスジェニックゼブラフィッシュ仔魚12 を使用しました。すべてのデータ取得と画像の後処理は、研究または教育ライセンスを持つオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して…
Representative Results
現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの調製とマイクロインジェクション、ライトシートイメージングと4D画像再構成、細胞追跡とVRインタラクションの3つの主要なステップで構成されています。ゼブラフィッシュの成体を交尾させ、受精卵を採取し、必要に応じてマイクロインジェクションを行い、実験を行いました(図1)。このステップは、心臓の発達と再生の研?…
Discussion
ゼブラフィッシュモデルと工学的手法の統合は、心筋梗塞、不整脈、先天性心疾患のin vivo探索に大きな可能性を秘めています。ゼブラフィッシュの胚や幼生は、その光透過性、再生能力、ヒトとの遺伝的・生理学的類似性を活かして、研究に広く利用されています1,2,4。優れた時空間分解能、最小限の光損傷、およ…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ボストン小児病院のキャロライン・バーンズ博士には、トランスジェニックゼブラフィッシュを惜しみなく共有していただき、感謝の意を表します。エリザベス・アイバニェスさんには、UTダラスでのゼブラフィッシュの飼育を手伝っていただき、感謝しています。また、UTダラスのD-インキュベーターメンバーから建設的なコメントをいただいたことにも感謝します。この研究は、NIH R00HL148493(Y.D.)、R01HL162635(Y.D.)、およびUT Dallas STARSプログラム(Y.D.)の支援を受けました。
Materials
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER |
| Animal models | ||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 |
| Software and algorithms | ||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 |
| Light-sheet system | ||
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A |
| 4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 |
| 20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU |
| Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 |
| Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M |
| Rotation stepper motor | Pololu | 1474 |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX |
| Microinjector and vacuum pump | ||
| Microinjector | WPI | PV850 |
| Vacuum pump | Welch | 2522B-01 |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT |
| Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 |
| Virtual reality hardware | ||
| VR headset | Meta | Quest 2 |
| 30mg/L PTU solution | ||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 |
| 1X E3 working solution | – | – |
| 1% Agarose | – | – |
| Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 |
| Deionized water | – | – |
| 10g/L Tricaine stock solution | ||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 |
| Deionized water | – | – |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 |
| 150mg/L Tricaine working solution | ||
| 10g/L Tricaine stock solution | – | – |
| Deionized water | – | – |
| 60X E3 stock solution | ||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl |
| Potassium Chloride | – | KCL |
| Calcium Chloride Dihydrate | – | CaCL2 x 2H2O |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | – | MgSO4 x 7H2O |
| RO Water | – | – |
| 1X E3 working solution | ||
| 60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | – |
| RO Water | – | – |
| 1% Methylene Blue (optional) | – | C16H18ClN3S |
参考文献
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