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シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウ...

Research Article

シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

DOI: 10.3791/66550

April 5, 2024

, , , , , , , ,

1CNC-UC - Center for Neuroscience and Cell Biology,University of Coimbra, 2CIBB - Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology,University of Coimbra, 3IIIUC - Institute for Interdisciplinary Research,University of Coimbra, 4ViraVector - Viral Vectors for Gene Transfer Core Facility,University of Coimbra, 5FFUC - Faculty of Pharmacy,University of Coimbra, 6MICC-CNC - Microscopy Imaging Center of Coimbra - CNC,University of Coimbra

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Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

この原稿では、最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、アデノ随伴ウイルスベクターを生成および精製するための詳細なプロトコルについて説明します。シンプルでスケーラブル、かつ費用対効果の高いアプローチを提供し、超遠心分離の必要性を排除します。得られたベクターは、高い純度と生物学的活性を示し、前臨床試験でその価値を証明しています。

Abstract

アデノ随伴ウイルス(AAV)は、 in vivo 遺伝子送達のベクターとしてますます価値が高まっており、現在、ヒトでの臨床試験が行われています。ただし、AAVを精製するために一般的に使用される方法は、塩化セシウムまたはヨージキサノール密度勾配超遠心分離を利用します。これらの分析法は、その利点にもかかわらず、時間がかかり、拡張性に限界があり、多くの場合、純度の低いベクターになります。これらの制約を克服するために、研究者はクロマトグラフィー技術に注意を向けています。ここでは、AAVの精製のための普遍的な捕捉ステップとして機能する最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィープロトコルを紹介します。

この方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対するAAV血清型2(AAV2)の固有の親和性に依存しています。具体的には、プロトコルは、所望のAAVキャプシドタンパク質をコードするプラスミドとAAV2のものとの同時トランスフェクションを伴い、両方の親血清型の特性を兼ね備えたモザイクAAVベクターを生じる。簡単に言うと、生産者細胞の溶解後、AAV粒子を含む混合物を、標準的な高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムを使用して最適化されたシングルステップヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルに従って直接精製します。精製されたAAV粒子は、その後濃縮され、純度と生物活性の観点から包括的な特性評価を受けます。このプロトコルは、超遠心分離やグラジエントを必要とせずに実行できるシンプルでスケーラブルなアプローチを提供し、クリーンで高いウイルス力価をもたらします。

Introduction

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、現在の遺伝子治療研究で最も有望な送達システムの1つとして、その道を征服しつつあります。1965年に最初に同定されたAAVは、直径約25 nmの正二十面体タンパク質キャプシドを持ち、一本鎖DNAゲノムを持つ小さな非エンベロープウイルスです。AAVは、溶解サイクルを完了するために、単純ヘルペスウイルスや、より頻繁にはアデノウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染に特有に依存するため、パルボウイルス科および依存パルボウイルス属に属します2,3。

AAVの4.7キロベースのゲノムは、特徴的なT字型のヘアピンエンドを形成する2つの逆終端反復(ITR)に隣接する2つのオープンリーディングフレーム(ORF)で構成されています4。ITRは、AAVのパッケージング、複製、および統合に不可欠な唯一のシス作用要素であるため、組換えAAV(rAAV)ベクターに保持される唯一のAAV配列です。このシステムでは、ベクター産生に必要な遺伝子がトランスで別々に供給され、目的の遺伝子をウイルスキャプシド5,6内にパッケージ化することができます。

各ウイルス遺伝子は、選択的スプライシングと開始コドンによって異なるタンパク質を体系化します。Rep ORF内では、4つの非構造タンパク質(Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78)がコードされており、ウイルスDNAの複製、部位特異的な統合、およびカプセル化に重要な役割を果たしています7,8。Cap ORFは、N末端で互いに異なる3つの構造タンパク質(VP1、VP2、およびVP3)を発現するためのテンプレートとして機能し、それらが集合して1:1:10 4,9の比率で60量体ウイルスカプシドを形成します。さらに、非従来型のCUG開始コドンを持つCap遺伝子にネストされた代替ORFは、アセンブリ活性化タンパク質(AAP)をコードしています。この核タンパク質は、新しく合成されたカプシドタンパク質VP1-3と相互作用し、カプシドの集合を促進することが示されています10,11。

カプシドのアミノ酸配列の違いは、ヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離された11の天然に存在するAAV血清型および100を超える変異体を説明する7,12,13。構造的に変化する領域のコンフォメーションの変化は、異なる株由来のカプシドの明確な抗原特性と受容体結合特異性を支配します。これにより、異なる哺乳類の器官間で異なる組織指向性と形質導入効率がもたらされます14。

rAAVの初期の製造方法は、ヘルパー目的でアデノウイルス感染に依存していました15,16,17,18,19。効率的で、通常は大規模に生産しやすいにもかかわらず、この感染からいくつかの問題が発生します。精製および不活化のための熱変性ステップの後でも、アデノウイルス粒子はAAV調製物中にまだ存在する可能性があり、望ましくない安全性の問題を構成する20。さらに、変性したアデノウイルスタンパク質の存在は臨床使用には受け入れられません。他の生産戦略は、Rep/Capおよび導入遺伝子を標的細胞21またはバキュロウイルス−昆虫細胞系22に持ち込むように操作された組換え単純ヘルペスウイルス株を利用する。これらのシステムは、スケーラビリティとGMP互換性の点で利点がありますが、それでも同様の問題に直面しています。

これらの問題を容易に克服するために、rAAV産生のためのトリプルトランスフェクション法が一般的に採用されています。簡単に言うと、rAAVアセンブリは、以下をコードする3つのプラスミドを持つ細胞の一過性トランスフェクションに依存しています:1)野生型AAV2ゲノム(pITR)のITR間に充填された導入遺伝子発現カセット。2)複製およびビリオンアセンブリ(pAAV-RC)に必要なRep/Cap配列。3)ヘルパー効果に必要なアデノウイルス関連RNA(pHelper)6,20,23。プラスミドトランスフェクション法は、前臨床試験におけるrAAV産生に簡便性と柔軟性を提供しますが、これらの手順を大規模生産に適用する場合、スケーラビリティと再現性の点で限界があります。別のアプローチとして、AAV Rep/Cap遺伝子またはRep/Capのいずれかをベクターコンストラクトと組み合わせて安定的に発現するAAV産生細胞株(接着増殖と浮遊増殖の両方)を使用することで、rAAV産生を達成できます。これらのシステムでは、アデノウイルスヘルパー遺伝子はプラスミドトランスフェクションによって導入されます。この戦略は細胞培養プロセスのスケーラビリティを向上させますが、技術的には複雑で時間がかかります21,24,25。

いずれの場合も、生産者細胞を溶解し、1つまたは複数の精製ステップに供します。現在、rAAVを精製するための主要な方法には、塩化セシウム(CsCl)またはヨージキサノールの超高速密度勾配遠心分離の使用が含まれ、クロマトグラフィー技術がそれに続くかどうか26。ウイルス沈殿の元の精製スキームでは、硫酸アンモニウムを使用し、その後、CsCl勾配による2〜3ラウンドの超遠心分離を行いました。このプロセスの主な利点には、すべての血清型を精製できることと、異なる密度に基づいて空のカプシドから完全な粒子を物理的に分離できることが含まれます。ただし、この方法は精巧で時間がかかり、スケーラビリティが限られているため、多くの場合、収量が悪くなり、サンプル品質が低下します27,28,29,30。さらに、CsClが哺乳類に及ぼす可能性のある毒性作用のために、in vivo研究の前に生理学的緩衝液に対する透析が必要になることがよくあります。

ヨウ素酸は、rAAVベクターを精製するための代替等浸透圧グラジエント培地としても使用されており、安全性とベクター力価の両方の観点からCsClよりも優れています。しかし、CsClと同様に、ヨージキサノール法は、細胞培養ライセートの負荷容量(したがってrAAV精製のスケーラビリティ)に関連するいくつかの欠点を提示し、時間と費用のかかる方法のままである30,31。

これらの制約を克服するために、研究者はクロマトグラフィー技術に注意を向けました。この点に関して、親和性クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー法、またはイオン交換クロマトグラフィー法のいずれかを組み込んだいくつかの精製アプローチが開発されました。これらの方法は、天然の受容体を含む特定の血清型の生化学的特性、またはウイルス粒子の電荷特性に依存する32。例えば、AAV2、AAV3、AAV6、AAV13がヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)に好ましく結合するという発見により、アフィニティークロマトグラフィー精製に近縁なヘパリンを使用する可能性が開かれました。しかし、HSPGへの結合部位は血清型によって異なり、AAVの付着と標的細胞の感染を異なる方法で媒介する2,33,34,35,36。一方、AAV1、AAV5、AAV6はN結合型シアル酸(SA)に結合するのに対し、AAV4はO結合型SAを使用します2,14,34。同じ理論的根拠に従って、SA37 に高度に濃縮された哺乳類タンパク質であるムチンの使用に基づいて、rAAV5 の精製のためのシングルステップアフィニティークロマトグラフィープロトコルも開発されました。ヘパリンベースの技術と同様に、この精製も生成される特定の血清型に依存します。ヘパリンとムチンとは別に、A20モノクローナル抗体やラクダ科の単一ドメイン抗体(AVBセファロースとPOROS CaptureSelect)など、他のリガンドがアフィニティークロマトグラフィーで検討されています22,23,38,39,40,41。既存の精製方法を改善するための他の革新的な戦略には、特定の結合エピトープを提示するためにrAAVキャプシドに小さな修飾を導入することが含まれます。例えば、ヘキサヒスチジンタグ付きまたはビオチン化rAAVは、それらのエピトープを標的とするリガンド(それぞれニッケルニトリロ三酢酸およびアビジン樹脂)を用いて精製することができる42,43,44。

rAAVの望ましい特性を広げるために、研究者はカプシドを混合することによってビリオンを女装させました。これは、生産中に2つの異なるAAV血清型からカプシド遺伝子を等モルまたは異なる比率で供給することによって達成され、異なる血清型34、45、46、47、48、49、50のカプシドサブユニットの混合物からなるカプシド構造を生じさせる.以前の研究では、AAV2とAAV1(1:1の比率)およびAAV2とAAV9(1:1の比率)のカプシドタンパク質を共発現すると、モザイクrAAV1/2およびrAAV2/9ベクターがそれぞれ生成されるという物理的証拠が提供されています45,46,48。モザイクrAAVの生成の主な利点は、異なるAAV血清型からの有利な形質を統合する能力であり、その結果、導入遺伝子発現と親和性の相乗的な改善をもたらし、rAAV産生中に有用な他の特性を維持します。興味深いことに、特定のモザイク変異体は、いずれかの親ウイルスとは異なる新しい特性を示すことさえあります46,47,49。AAV2のヘパリン結合能を利用することにより、AAV2を指向性進化および/または合理的設計によって生成された他の天然または新しいAAVキャプシドと混合することにより、モザイクrAAVベクターを生成および精製できる可能性があります。それにもかかわらず、以前の研究では、モザイクベクターを組み立てようとする際のキャプシドサブユニットの適合性の重要性が強調されています。例えば、Rabinowitzらは、AAV1、AAV2、およびAAV3のトランスカプセル化がモザイクカプシドの効率的な共集合につながったが、これらの血清型とAAV4との異性装が安定なビリオンの生成を妨げたことを実証した34,45,47。さらに、AAV1、AAV2、およびAAV3は、これらのカプシドを異なる比率で混合した場合に得られるウイルス力価が低下したため、AAV5との適合性が低いことを示しました。興味深いことに、モザイクrAAV2/5は、親AAV5と同様にムチン結合能力を維持しながら、ヘパリン結合特性の低下を示しました。しかし、3:1の比率のrAAV3/5は、ヘパリンとムチンへの二重結合を維持した。全体として、形質導入の強化、特異的な親和性、または免疫原性の低い新しいモザイクrAAVの作製は、カプシドの集合体と受容体の相互作用を理解することから大きな恩恵を受ける可能性がありますが、特定の組み合わせには依然として徹底的な調査と最適化が必要です。

本研究では、最適化されたヘパリンアフィニティークロマトグラフィー法を用いたrAAVの製造と精製のための段階的なプロトコルについて説明します。rAAV は一過性トランスフェクションによって産生され、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムを使用して精製されます。選択された精製画分を濃縮した後、得られたウイルスストックは、力価、純度、固有の物理的特性、およびin vitroおよびin vivoの生物学的活性の点で特徴付けられます。概念実証として、モザイクrAAV1/2およびrAAV2/9ベクターの生成に対するこのプロトコルの改善と適用性を実証します。各血清型の選択は、それらの著しく異なる向性に基づいており、モザイクバージョンにも独自の特徴を与えている可能性があります。AAV血清型1は、中枢神経系(CNS)に対して全体的に中程度の親和性を持ち、ニューロンとグリアを(程度は低いが)形質導入する能力を持ち、in vivoで順行性および逆行性の方向に軸索輸送を受けます2,7,8。さらに、AAV血清型9は、新生児および成体マウスの両方において、血液脳関門を通過し、CNSを標的とする自然な能力のために選択された51,52。最後に、AAV血清型2は、ヘパリンに結合する能力を考慮して選択され、アフィニティークロマトグラフィー33が可能になった。精製されたrAAV1/2およびrAAV2/9粒子は、両方の親AAV血清型の特性を兼ね備えており、したがって、CNS45,46,48,49の形質導入に適したベクターを構成する。

Protocol

注:プロトコルの概要を示す図については、 図1 を参照してください。このプロトコルで使用されるすべての材料、器具、および試薬の詳細については、 材料の表 を参照してください。細胞やウイルスに関するすべての作業は、細胞株のメンテナンスに通常使用されるものとは別に、専用のバイオセーフティキャビネットやインキュベーターで行う必要があります。培養細胞やウイルスと接触する機器や試薬は無菌でなければなりません。ウイルスに汚染された有害試薬や物質の廃棄は、製品安全データシートに従い、各国の環境安全衛生局が定める国内法やガイドラインを遵守して行うことが不可欠です。2019年4月現在、組換えまたは合成核酸分子を含む研究に関するNIHガイドラインは、すべてのAAV血清型、および組換えまたは合成AAV構築物をリスクグループ1の薬剤(健康な成人ヒトの疾患に関連しない)として分類しています。この分類は、導入遺伝子が潜在的に腫瘍形成の可能性のある遺伝子産物または毒素をコードしておらず、構築物がヘルパーウイルスなしで産生される場合に適用されます。

動物を含むすべての実験は、2013年にポルトガルの法律(Decree Law 113/2013)に置き換えられた、実験動物の管理と使用に関する欧州連合共同体指令(2010/63/EU)に準拠して実施されました。さらに、動物法は、医学部の動物福祉担当組織およびコインブラ大学の認可された動物施設の神経科学および細胞生物学センターによって承認されました。研究者たちは、実験を行うために、ポルトガル当局(ポルトガル、リスボンのDirecção Geral de Alimentação e Veterinária)から適切なトレーニング(FELASA認定コース)と認定を受けました。

1. プラスミドコンストラクト

  1. maxiprepエンドトキシンフリーキットの製造元の指示に従って、次のプラスミドのかなりの量のDNAを分離および精製します:i)pITR:目的の転写ベクター。ii)pAAV-RCプラスミド:AAV2 RepおよびCap配列を含むpRV136;iii)pAAV-RCプラスミド:pH21、AAV1 RepおよびCap配列36を含む;iv) pAAV-RC プラスミド: pAAV2/9n、AAV2 Rep および AAV9 Cap 配列を含む;v)pHelper:pFdelta6、アデノウイルスヘルパープラスミド36。
  2. 推奨される酵素的制限を行うことにより、生成されたプラスミドの完全性をスクリーニングする36。ITRの不安定な部分内で2回切断される制限エンドヌクレアーゼであるSmaIによる消化により、pITRプラスミドの完全性をモニターします53,54。
    注:ITRは非常に不安定で欠失しやすいため、これらの部位での組換えを最小限に抑えるために、SURE 2スーパーコンピテントセルの使用が推奨されます。

2. 細胞培養

  1. 培養ヒト胚性腎臓293、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)高グルコースでSV40ラージT抗原(HEK293T)細胞株を安定的に発現させ、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを37°Cで、5%CO2を含む加湿雰囲気下で、後続のステップの開始点として。
  2. 滅菌済み1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4を使用して細胞を継代培養し、細胞を洗浄してから、0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加します。
    注:継代回数が多すぎる細胞(最大20個)は使用しないでください。細胞培養物にマイコプラズマ汚染がないか定期的に試験します。

3. 一過性トランスフェクションによるrAAV産生

  1. 1日目:セルめっき
    1. 各ウイルス産生について、トランスフェクションの前日に、22 mLの添加培地に1皿あたり10.5 × 106細胞の 密度で、細胞HEK293T 10個の処理済み培養皿(直径15 cm)にプレートし、細胞が70%〜80%コンフルエントになり、トランスフェクションの準備が整うまで24時間インキュベートします。
  2. 2日目:ポリエチレンイミン(PEI)を用いた細胞導入
    1. 各ウイルス産生(10.5皿に相当)について、以下のトランスフェクション混合物を微量遠心チューブにセットします:54.6 μgのpITR;45.675μgのpRV1;45.675μgのpH21またはpAAV2 / 9n;109.2μgのpFδ6。タッピングで混ぜます。
    2. 50 mLの遠心分離チューブで、4.557 mLの非添加DMEMに混合物を加えます。タッピングで混ぜます。
    3. 1.365 mLの滅菌PEI溶液を1 mg / mL(pH 7.4)で一滴ずつ加えます。.タッピングで混ぜます。室温で10分間インキュベートして、DNA-PEI複合体の形成を可能にします。
    4. この混合物を231mLの予熱済みサプリメントDMEMに加えます。.各ディッシュの培養培地全体を、このトランスフェクション混合物22mLと交換します。細胞を48時間インキュベートします。
      注:この手順は、細胞の剥離を避けるために注意して実行する必要があります。
  3. 4日目:細胞採取
    1. pITRが蛍光レポーターをコードしたら、トランスフェクションされた細胞を蛍光顕微鏡で可視化します。
    2. 各ディッシュから培地を50 mLの遠心チューブに集め、800 × g で10分間遠心分離します。上清を捨てます。
      注:このステップはオプションであり、非常に高いコンフルエンシーのために剥離した可能性のあるトランスフェクション細胞を回収することを目的としています。
    3. 各プレートに10mLの予熱PBSを加えます。細胞スクレーパーで細胞を静かに除去し、ステップ3.3.2から懸濁液を50mLの遠心分離チューブに回収します。
    4. 追加の10 mLのPBSで一度に5つの皿を洗い、ステップ3.3.3から50 mLの遠心チューブに懸濁液を移します。細胞を800× g で10分間ペレット化し、上清を捨てます。
    5. 細胞ペレットを-80°Cで凍結します。
      注:セルペレットは数ヶ月間保存することができます(一時停止ポイント)。

4. rAAV抽出とFPLC精製

  1. 5日目:細胞溶解液の調製
    1. 細胞ペレットを室温で解凍します。10皿から採取した細胞を、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)および20 mMトリス(pH 8.0)を含む滅菌緩衝液100 mLに超純水(I型)に再懸濁します。均質な懸濁液を確保するために、ピペッティングで上下させて懸濁液を混合します。
    2. 超純水に10%デオキシコール酸ナトリウムの新しく調製した滅菌溶液12.5mLを加えて、細胞溶解を誘導します。ピペッティングで上下に混ぜます。
      注意: デオキシコール酸ナトリウムとそれと接触している材料は、製品安全データシートおよび機関の環境衛生安全局が提供するガイドラインに従って廃棄してください。また、このパウダーを取り扱う際はフェイスマスクの着用もお勧めします。混合後、溶液は非常に粘性になります。
    3. 前の混合物に27 μLのベンゾナーゼヌクレアーゼを加えます。サンプルの粘性がなくなるまで、ピペッティングで上下に完全に混合します。37°Cで1時間インキュベートし、10分ごとにボルテックスを行います。
      注:このエンドヌクレアーゼは、タンパク質分解活性を示すことなく、あらゆる形態のDNAおよびRNAを効率的に分解することができます。
    4. 混合物を3,000 × g で25°Cで60分間遠心分離することにより、細胞の破片を除去します。 0.45 μmの滅菌ポリフッ化ビニリデン(PVDF)シリンジフィルターで上清をろ過し、新しい滅菌容器に移します。
      注:この重要なステップにより、細胞の破片のほとんどが確実に除去され、クロマトグラフィーカラムの目詰まりが防止されます。この混合物の少量のアリコートを分析用に保存します(オプションのステップ)。
  2. 5日目(続き):rAAVのヘパリンカラム精製
    注:サンプルアプリケーションは、システムの一部としてサンプルポンプまたは50mLまたは150mLのスーパーループを使用して実行できます。低温ではより多くの空気が溶解するため、FPLCシステムで使用する前に、バッファーと溶液(通常は4°Cで保存)が室温に順応するのに十分な時間を確保することが重要です。
    1. オプション:システムを長期間保管した場合は、手動の指示または事前定義されたシステム洗浄(システムCIP)方法を使用して、システムおよびすべての入口に新たに調製した保存溶液(20%エタノール)を充填します。
    2. 手動の指示または事前定義されたシステムCIPメソッドを使用して、液体の流路を滅菌超純水で完全に洗浄します。
    3. 1 mL の充填済みヘパリンカラムを接続し、圧力アラームをセットして、5 カラム容量(CV)の超純水で 1 mL/分の流速で洗浄します。
    4. バッファートレイ内の溶液を超純水から、入口A(システムポンプA)のバッファーA(超純水中の100 mM NaClおよび20 mMトリスの滅菌溶液、pH 8)に、入口B(システムポンプB)のバッファーB(超純水中の500 mM NaClおよび20 mMトリスの滅菌溶液、pH 8)に切り替えます。システムにサンプルポンプがある場合は、サンプルインレットバルブのバッファーインレットをバッファーAに配置します。
    5. システムポンプBをバッファーBで洗浄し、残りの液体流路をバッファーAで満たします。
      注:必要に応じて、カラムを流路から切り離し、後で再接続します。
    6. サンプルインレットバルブからのサンプルインレットチューブ(S1など)を、ステップ4.1.4で得られたウイルス調製物を入れた容器に挿入します。(細胞溶解物調製物から)。サンプルインレットS1から注入バルブまでの流路をサンプル溶液でプライミングします。または、50 mL シリンジを使用して、rAAV を含むサンプルを 50 mL または 150 mL のスーパーループに充填します。
    7. 1 mL/分の速度でバッファー B の 12.5% を使用して、総容量 5 CV でカラムを平衡化します。
    8. サンプルポンプ( エアセンサーを使用してすべてのサンプルを注入を選択)またはスーパーループを使用してサンプルの総量をカラムに0.5 mL/minで塗布し、新しい滅菌容器の出口ポートを使用してフロースルーを収集します。
      注意: 過圧を防ぐための流量制御 機能が有効になっている場合、カラムが目詰まりした場合、流量は自動的に減少します。流速が 0.5 mL/分を大幅に下回った場合は、サンプル塗布を中止し、バッファー A を 2-5 CV で洗浄してから、サンプル塗布を再開します。
    9. カラムをバッファー A 20 CV で 1 mL/分で洗浄し、アウトレットポートを使用してフロースルーを収集します。
    10. 以下のスキームでサンプルを1mL/分溶出します:i)5つのCVに対してバッファーBの50%をターゲットとする線形グラジエント。ii)5つのCV中にバッファーBの90%を目標にステップする。iii)5回のCV中にバッファーBの100%を目標にステップします。
    11. 溶出したサンプルをフラクションコレクターと低保持マイクロ遠心チューブ(2 mL)を使用して1 mLのフラクションで回収し、-20°Cで保存します。
      注:rAAVフラクションは数週間保存される場合があります(一時停止ポイント)。
    12. カラムを 1 mL/分でバッファー B 12.5% で 5 CV 再平衡化します。
    13. 注入口をバッファー溶液から超純水に切り替え、カラムを 1 mL/分で 5 CV 洗浄します。
    14. 注入口を超純水から20%エタノールに切り替え、カラムを1 mL/分で5CV洗浄し、カラムを外して4°Cで保存します。
      注:同じrAAV血清型と導入遺伝子が使用されている場合、カラムは他の主要な洗浄および消毒手順なしで数回再利用できます。
    15. 手動の指示または事前定義されたシステムCIPメソッドを使用して、液体の流路を20%エタノールで完全に洗浄します。

5. 精製されたrAAVの濃度

  1. 6日目:集中ステップ1
    1. 分子量100 kDaのカットオフ値を持つ15 mL遠心フィルターユニットを使用して、rAAVを濃縮します。rAAVを含む所望の画分(FPLC画分7〜16)を15 mL遠心フィルターユニットにロードし、室温で2,000 × g で2分間遠心分離します。フィルターユニット内の濃縮容量が約500μLであることを確認してください。濃縮容量が500 μLを大幅に超える場合は、目的の容量に達するまで1分間隔で遠心分離ステップを繰り返します。
  2. 6日目(続き):バッファー交換
    1. rAAVを含む遠心フィルターユニットに滅菌PBS1mLを加えます。慎重に上下にピペットで動かしてフィルターを洗います。最終容量が500 μLに達するまで、1分間隔で2,000 × g で遠心分離します。
  3. 6日目(続き):集中ステップ2
    1. 前のステップで得られた500 μLの濃縮rAAVを、分子量100 kDaカットオフの0.5 mL遠心フィルターユニットに移し、6,000 × g で1分間遠心分離します。必要に応じて、最終容量が100 μL未満になるまで遠心分離ステップを繰り返します。
  4. 6日目(続き):回復
    1. 濃縮されたrAAVを回収するには、フィルターデバイスを逆さまにして、新しい微量遠心分離機の収集チューブに入れます。キャップを中央に向けてチューブを微量遠心分離機に入れ、フローチャンバー内で長時間回転させて、濃縮されたrAAVをデバイスから微量遠心チューブに移します。または、1,000 × g で2分間遠心分離します。
    2. 滅菌プルロニックF-68 0.001%(オプション)を補充します。
      注:プルロニックF-68は、食品医薬品局によってヒトでの使用が承認された非イオン性界面活性剤であり、希釈調製、注射器の装填、および送達装置55,56中に使用される材料(プラスチック)の表面との相互作用を防ぐことにより、rAAVの損失を軽減することができる。
    3. rAAVを低保持マイクロ遠心チューブに分注し、-80°C(一時停止点)で保存します。

6. 精製されたrAAVの定量

  1. 6日目(続き):市販のキットを使用し、製造元の指示に従って、リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)により、ウイルスゲノム/μL(vg/μL)で発現するrAAV製剤の力価を決定します。
    1. rAAV粒子溶液をDNase Iと37°Cで20分間インキュベートします。
      注:この手順は、宿主細胞に由来する遊離ゲノムDNAおよびプラスミドDNAの消化を促進し、したがって、インタクトなrAAV粒子内の核酸配列のみが保存されるようにする。
    2. DNase Iを95°Cで10分間熱不活化します。
    3. Lysis Bufferを添加し、70°Cで10分間インキュベートして、rAAV粒子のタンパク質の熱変性を促進します。
    4. 得られた rAAV ゲノム溶液を希釈バッファーで希釈してから、RT-qPCR に進みます。キットに付属のポジティブコントロールの段階希釈標準試料のセット(2 ×107 vg/μL から 2 × 102 vg/μL まで)を調製します。
    5. 12.5 μLのTaq IIミックス、0.5 μLの希釈プライマーミックス、7 μLの水、および5 μLの希釈rAAV DNA(未知のAAVサンプルおよびステップ6.1.4の標準)を含む反応混合物を実行します。
    6. RT-qPCRは、95°Cで1サイクルで2分間(初期変性)、95°Cで40サイクルで5秒間(変性)、60°Cで30秒間(アニーリング、伸長、プレート読み取り)のプロトコルを使用して、リアルタイムPCR検出システムで実行し、その後、メルトカーブ分析を行います。
    7. rAAVサンプル調製から生じる希釈係数を考慮して、標準曲線(線形回帰直線)から絶対サンプル濃度を計算します。
      注:ウイルスゲノム数の定量化は、AAV2のITR配列(キットによって提供されるプライマーの標的配列)の増幅によって達成されます。

7. SDS-PAGE、クマシーブルー染色、ウェスタンブロット

  1. 6x サンプルバッファー(0.5 M Tris-HCl/0.4% Dodecyl Sufate (SDS) pH 6.8、30% グリセロール、10% SDS、0.6 M ジチオスレイトール(DTT)、0.012% ブロモフェノールブルー)を加え、サンプルを 95 °C で 5 分間インキュベートして、各サンプルの 40 μL (各 FPLC 画分、フロースルー、プレカラムサンプル、および最終濃縮産物の合計 2.3 × 1010 vg )を変性させます。
  2. 変性したサンプル(48 μL)をSDS-ポリアクリルアミドゲル(4%スタッキングゲル、10%分離ゲル)にロードし、タンパク質ラダーに隣接して100 Vで70分間電気泳動分離を行います。
  3. タンパク質分析
    注:クマシーブルー染色またはウェスタンブロッティングのいずれかを実行できます。
    1. クマシーブルー染色
      1. タンパク質バンドを可視化するには、50%メタノールと10%酢酸氷に溶解した0.25%クマシーブルーG250溶液でゲルを10分間染色します。
      2. メタノール25%、酢酸5%の氷河を含む溶液で、バックグラウンドの低い透明なバンドが見えるまで数回洗浄し、ゲル脱染を行います。
      3. 適切なイメージングシステムを使用して画像をキャプチャします。
    2. ウェスタンブロット
      1. 標準的なプロトコルに従って、タンパク質をPVDFメンブレンに移します。
      2. TBS-T(0.1%Tween 20 in Tris緩衝生理食塩水)で希釈した5%脱脂乳を室温で1時間インキュベートすることにより、メンブレンをブロックします。
      3. 4°Cで一晩インキュベートするには、以下の一次抗体(ブロッキング溶液で希釈したもの)を使用してください:マウスモノクローナル抗AAV、VP1、VP2、VP3抗体(B1、1:1,000)、またはマウスモノクローナル抗AAV、VP1、VP2抗体(A69、1:1,000)。
      4. メンブレンをTBS-Tで3 x 15分間洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体(1:10,000)と室温で2時間インキュベートします。
      5. TBS-Tでメンブレンを3 x 15分間洗浄します。強化された化学蛍光基質(ECF)を添加し、化学蛍光イメージングによってタンパク質バンドを可視化します。

8. 透過型電子顕微鏡(TEM)

  1. Formvarカーボンコーティングされた200メッシュグリッドを逆さまにして、rAAVサンプルの滴の上に置き、1分間沈殿させます。
  2. グリッドを一滴の水で洗い、余分な液体を濾紙で乾かします。
  3. 1%酢酸ウラニル溶液(pH 7)でグリッドを1分間ネガティブ染色し、ウイルス粒子を固定して造影します。
  4. グリッドを一滴の水で洗い、余分な液体を濾紙で乾かします。
  5. 透過型電子顕微鏡で試料を検査します。
    注:高塩濃度は、rAAVのグリッドへの結合に直接影響を与え、結晶様構造の可視化につながる可能性があります。

9. 連続的な紫外可視光吸収、静的光散乱、動的光散乱解析

  1. 96ウェル定量プレートに、2 μLのrAAVサンプルと2 μLのPBSをロードして、バッファーブランクとして使用します(これを重複して実行します)。
  2. クライアント解析ソフトウェアのAAV Quantアプリケーションを使用して、サンプルの名前をプレートの正しい位置に置き、 AAV血清型を選択して、 Nextをクリックします。
  3. 96ウェル定量プレートを専用装置にロードし、データ取得のためのプレート読み取りを進めます。

10. in vitro 形質導入アッセイ

  1. さまざまな細胞株を使用して、rAAVの形質導入効率を迅速に分析できます。
    1. 24ウェルプレート(密度137,500細胞/ウェル)およびマウス神経芽細胞腫-2A(Neuro2a)細胞株に、24ウェルプレート(50,000細胞/ウェル)または8ウェルチャンバースライド(27,000細胞/ウェル)のいずれかで、上記のように10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM高グルコースを用いて、HEK293T細胞を均等に播種する。細胞を37°Cで一晩接着させ、5%CO2を含む加湿雰囲気で接着させます。
    2. 各ウェルから馴化培地(24ウェルプレートから250 μL、8ウェルチャンバースライドから50 μL)を回収し、後で使用するために4°Cで保存します。
    3. 以下のrAAV調製物を各ウェルに加え、細胞を5%CO2 雰囲気中で37°Cで24時間インキュベートします。
      1. FPLCで回収したフラクションF2-F16を50 μL加え、24ウェルプレートに播種したHEK293T細胞にフロースルーします。
      2. 50 μLのPBSで希釈した濃縮rAAVの合計5.5 × 109 vgを、24ウェルプレートに播種したNeuro2a細胞に添加します(50 μLのPBSを細胞に添加することにより、ネガティブコントロールウェルを含む)。
      3. 25 μLのPBSで希釈した濃縮rAAVの合計2.75 × 109 vgを、8ウェルチャンバースライドでプレーティングしたNeuro2a細胞に加えます(50 μLのPBSを細胞に添加して、ネガティブコントロール条件を含めます)。
    4. 以前に保存した馴化培地(ステップ10.1.2)を各ウェルに加え、24時間インキュベートします。
    5. 培地を廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄します。
    6. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液にPBS溶液を添加し、37°Cに予熱して各ウェルに添加し、室温で20分間インキュベートします。
    7. PBSで2回洗浄し、イメージングが行われるまで4°Cで保存します(一時停止ポイント)。
    8. 10倍/0.30対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡、または40倍/1.4オイルDIC対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡で画像を取得します。
  2. in vivo環境のより適切で反射的なモデルを得るには、次のように初代ニューロン培養を使用します。
    1. Santosらによって以前に記述された皮質ニューロンの初代培養物を調製する。57.簡単に、200,000細胞/ mLを12ウェルプレートに播種し、 in vitro 16日目まで培養に保持します。
    2. 各ウェルから馴化培地(100 μL)を採取し、後で使用するために4°Cで保存します。
    3. 試験するrAAVを各ウェルに加えます:25μLのPBSで希釈した濃縮rAAVの合計2.75×109 vg(ネガティブコントロールを含む:25μLのPBS)。5% CO2 雰囲気中で37°Cで24時間インキュベートします。
    4. 予め保存した馴化培地を加え、24時間インキュベートする。
    5. 各ウェルの培地を捨て、PBSで2回洗浄します。
    6. ステップ10.1.6で説明したように、PBS中の4%PFA/4%スクロースで細胞を固定します。PBSで2回洗ってください。
    7. Alexa Fluor 633と結合した5 μg/mLの小麦胚芽凝集素(WGA)と室温で10分間、各ウェルをインキュベートします(オプションのステップ:代わりに免疫細胞化学を実行します)。PBSで2回洗ってください。
    8. 0.25% Triton X-100 in PBSで5分間、室温でインキュベートします。PBSで洗ってください。
    9. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)と室温で5分間インキュベートします。PBSで2回洗ってください。
    10. 40倍/0.95対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡、または40倍/1.4オイルDIC対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡で画像を取得します。

11. 生体内 実験

注:動物は温度管理された部屋に収容され、12時間の明暗サイクルで維持されました。食料と水は 自由に提供されました。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。

  1. 小脳への脳定位注射
    1. 気化器に接続されたチャンバー内の酸素 (0.8 L/分) の存在下で 2% イソフルランを吸入することにより、9 週齢の C57BL/6 動物に麻酔をかけます。
    2. 麻酔をかけた動物を定位固定装置(35°Cの温めたパッドの上)に入れ、イソフルランマスクを動物の鼻に入れます。イソフルランレベルを1.3〜1.7%に下げます。
      注:続行する前に、動物が正しく麻酔されていることを確認してください(両方の後肢の屈曲に対する反射の喪失)。
    3. 角膜の乾燥を避けるために潤滑剤の眼軟膏を塗布し、承認された鎮痛剤を動物に注射します。
      注:後続のすべての手順は、無菌状態で実行する必要があります。
    4. 動物の頭の毛皮を剃り、手術部位を消毒した後、頭蓋骨を露出させ、10μLのハミルトン注射器に接続された30Gの鈍い先端注射針の先端をブレグマの真上に置きます(脳定位固定装置の座標の計算にはブレグマをゼロとして使用します)。
    5. 針を目的の座標に移動し、針が入る頭蓋骨に穴を開けます。
      注:この研究の枠組みでは、単回注射が小脳の中心で行われました。
    6. 自動インジェクターを使用して、PBSで希釈した合計8 × 109 vgを含むrAAVの溶液4μLを注入します。bregmaから計算された以下の座標を使用して、成体C57BL / 6マウスの小脳の中心に単回注射を行う:前後:-6.5mm;横方向:0 mm;腹側:-2.9 mm。
      注:これらの座標は、マウスの系統、性別、および使用中の動物の年齢によって異なる場合があります。
    7. 逆流を最小限に抑え、ウイルスベクターの拡散を可能にするために、注入が完了したら、シリンジ針をこれらの座標に3分間放置し、次にゆっくりと0.3mm引っ込め、マウスの脳から完全に除去する前にさらに2分間所定の位置に留まらせます。
    8. 切開部を閉じ、消毒剤(例:10 %ポビドンヨード)で洗浄します。
    9. 動物を家のケージに戻す前に、麻酔から回復させます。
  2. 組織の収集と準備
    注:この実験では、形質導入レベルは注射後12週間で観察されましたが、注射後4週間で同じ手順を評価できました。
    1. キシラジン/ケタミンの過剰摂取(8/160 mg / kg体重)の腹腔内投与により、動物に終末麻酔をかけます。.
    2. 氷冷PBSを2.5mL/分の割合で6分間経心灌流し、続いて調製したばかりの氷冷4%PFA溶液を同じ速度で10分間灌流します。
    3. 切除した脳を室温で一晩4%PFAに浸し、凍結保護のために25%スクロース/ PBS溶液に移します。脳が沈んだら(約48時間後)、-80°Cで保存します。
    4. -21°Cのクライオスタットを使用して、厚さ30μmの連続矢状切片を切断します。 動物ごとに、0.05%アジ化ナトリウムを添加したPBSの浮遊切片として、解剖学的シリーズで脳半球の96の矢状切片を収集します。次の処理まで4°Cで保存してください。
  3. 標準的な蛍光免疫組織化学
    1. 動物ごとに8つの矢状切片を、互いに240μmの距離で選択します。
    2. フリーフローティング切片をブロッキング/透過化溶液(PBSに10%の正常ヤギ血清(NGS)を含む0.1% Triton X-100)で室温で1時間インキュベートします。
    3. 切片をチキンポリクローナル抗GFP一次抗体(1:1,000)とともに4°Cで一晩インキュベートします。
    4. PBSで15分間×3回洗浄し、Alexa Fluor 488蛍光色素に結合した二次抗体ヤギポリクローナル抗ニワトリ抗体(1:200)と室温で2時間インキュベートします。
    5. PBSで3 x 15分間洗浄します。DAPIと室温で5分間インキュベートします。
    6. PBSで3 x 15分間洗浄します。ゼラチンでコーティングされたスライドに切片を置き、蛍光封入剤で覆います。
    7. 20x/0.8対物レンズを装備したスライドスキャナー蛍光顕微鏡で画像を取得します。

Representative Results

この研究では、中枢神経系(AAV1やAAV9など)を標的化して形質導入する可能性のあるモザイクrAAV(図1に要約)の製造、精製、および特性評価のための詳細なプロトコルを提示し、同時にヘパリンアフィニティークロマトグラフィー精製(AAV2)に適しています。これを達成するために、天然のAAV血清型1、2、および9のカプシドを使用して、モザイクrAAV1 / 2およびrAAV2 / 9ベクターを開発しました。

開始する前に、プラスミド調製物の構造的完全性についてスクリーニングしました。クローニングフラグメントの正しい挿入を検証するために必要な消化に加えて、潜在的なITR欠失/挿入を検出するために、pITRプラスミドを一貫してスクリーニングすることが不可欠です。一例として、pITRプラスミドの異なるクローンにおけるITRの完全性を、制限酵素SmaIによるプラスミド消化後にモニターしました(補足図S1)。

両方のタイプのモザイクベクターは、標準的なトランスフェクション方法6に従って、それぞれのAAVキャプシドプラスミドを1:1の比率で共トランスフェクションすることによって生成されました。簡単に言うと、HEK293T細胞に、i)ITR(pITR)配列間に詰め込まれた目的の導入遺伝子を含むプラスミド、ii)AAV2とAAV1またはAAV9の野生型AAVゲノムRepおよびCap ORF(pAAV-RCプラスミド)を含むプラスミド、iii)アデノウイルスタンパク質(E1A、E1B、E4、およびE2A)およびヘルパー機能に不可欠なアデノウイルス関連RNA(pHelper)をコード化するプラスミドをトランスフェクションしました。48時間後、細胞を回収し、6,36、FPLCシステムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細胞ホモジネートからrAAVを精製した。図 2A に示すように、カラム平衡化(平衡化ステップ)後、rAAV を含む細胞ライセートをカラムに適用しました(サンプルローディング)。ヘパリン33 に対する rAAV2 の自然な親和性により、rAAV はカラムの樹脂に結合し、他の成分はランニングバッファー中で実行され、UV モニター(フロースルー)によって検出され、吸光度が増加しました。その後、カラムを洗浄し(洗浄ステップ)、NaCl濃度の上昇により最終的にrAAVを溶出させました(溶出ステップ)。溶出したウイルスをUVモニターで検出し、1mLの画分で回収しました。

rAAV1/2 および rAAV2/9 の代表的な溶出ピークプロファイルを それぞれ図 2B および 補足図 S2A に示し、異なるウイルスバッチは、フラクション F7 から F16 まで一貫して単一のピークを示します。ピーク高さはrAAVプロダクションによって異なり、ピークが高いほど通常、rAAVの収率が高くなります。生成されたrAAV1/2およびrAAV2/9の各画分を、その後、ウイルス力価を評価するためにRT-qPCRによって特徴付けました(図2C および 補足図S2B)。

溶出物質の純度を特徴付けるために、各画分およびそれぞれのフロースルーの40 μLを10%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べました(rAAV1/2については図2D 、rAAV2/9については 補足図S2C )。クーマシーブルー染色は、画分F7-F16に3つの主要なバンドを明らかにし、分子量はAAVのVP1(87 kDa)、VP2(72 kDa)、およびVP3(62 kDa)のキャプシドタンパク質に適切な比率で対応する14。どちらの場合も、UV吸光度、RT-qPCR、およびゲルバンド強度に基づいて、モザイクrAAVの大部分が画分F7およびF8に存在し、画分F9-F16で徐々に減少し始めることが明らかです。3つのウイルス性カプシドタンパク質に加えて、サイズが約17kDaの別のタンパク質(またはタンパク質)がF8〜F16の画分で検出されました。

この共精製タンパク質を除去するために、フラクションF7-16を100KDa遠心フィルターユニットを用いて濾過し濃縮し、RT-qPCRにより最終rAAV力価を決定した(rAAV1/2の図3A、Bを参照)。rAAV産生の最終収量は、pITRの長さと複雑さ、ITR配列の完全性、細胞培養条件(細胞継代数など)、およびトランスフェクション効率に依存します24,58,59,60,61。それでも、0.5 mL遠心フィルターユニットを使用してrAAV調製物を複数回遠心分離することにより、最終力価を調整できます(濃縮ステップ2)。このプロトコルに従って、50〜100μLの範囲の最終容量の場合、濃度は通常、2×〜109〜5×1010 vg /μLで構成されます(参照滴定キットを使用して行われた定量化)。

次に、最終的な rAAV 調製の純度を 10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで評価しました。 図3Cに示されているように、rAAV1/2調製物では、rAAVのカプシドタンパク質を表す3つのバンドのみが観察され、検出可能な共精製タンパク質は同定されなかった。これらの結果は、rAAV2/9について得られた結果と一致していた(補足図S2C)。rAAV1/2およびrAAV2/9ベクターの同一性を確認し、さらに純度を特徴付けるために、ウイルス画分および濃縮ストックを、特異的抗体B1(補足図S3A および 補足図S4A)およびA69(補足図S3B および 補足図S4B)を用いてウェスタンブロットで分析した。抗体B1は、ほとんどのAAV血清型のすべてのVPタンパク質に共通のC末端エピトープを認識するが62、クローンA69はVP1およびVP2のエピトープのみを認識する63。それにもかかわらず、分子量がVP3(<62 kDa)未満のかすかなバンドも、B1およびA69標識で検出できます。

rAAVの構造形態を特徴付け、さらに純度を評価するために、ウイルス粒子をTEMで直接可視化しました。この手法は、ウイルスサンプル中のサンプルの完全性と純度を評価するための標準的な手順であり、空および完全なrAAV粒子の定量、およびサンプル29、64、65、66、67の汚染の評価を可能にします。 図3Dに示すように、直径~25nmの大量のrAAV粒子がきれいな背景で観察できました。電子密度の高い中心を持つ空の粒子(黒い矢印)と完全なベクトル(白い矢印)も、サンプルフィールド全体で観察できました。

また、紫外可視(UV-Vis)分光法、静的光散乱(SLS)、および動的光散乱(DLS)を組み合わせたプラットフォームであるStunnerを使用して、精製されたrAAVの品質管理も行いました68。各サンプルについて、タンパク質の総量、ssDNA、ならびに吸収不純物およびバックグラウンドの濁度を、UV-Vis分光法によって測定した(図3E および 補足図S5A)。次に、SLSとDLSを適用して、rAAVキャプシドの光散乱挙動を評価しました。AAVの平均直径が25nmであることを考えると、直径15〜45nmの範囲内の粒子は無傷であると見なされます。大きな粒子は典型的にはウイルス凝集体を表し、より小さな粒子はすべて、組み立てられていないカプシドタンパク質を含む、最も可能性の高い小さな粒子を含む68。rAAV1/2では、インタクトなキャプシド粒子に対応する単一のピークが30 nm(図3F)で観察され、凝集強度は0%、小粒子強度は0%でした。rAAV2/9調製では、30 nmのピークも検出され、78%のキャプシド強度を示しました(補足図S5B)。小さな粒子強度は0%でしたが、このサンプルでは、平均直径620 nmの大きな凝集体からの主な寄与(19.9%)で、22%の凝集強度が測定されました(補足図S5B)。Stunnerは、UV-Vis分光法とSLSおよびDLS情報の組み合わせにより、 図3G および 補足図S5C に示す2つのウイルス調製物の全体的な総キャプシド力価、フルキャプシド力価、遊離タンパク質および凝集タンパク質、ならびに遊離および凝集ssDNAを明らかにしました(各図の凡例に特定の値を示します)。

並行して、開発したモザイクAAVベクターの生物学的活性を評価するために、HEK293T細胞に、rAAV1/2またはrAAV2/9のいずれかのFPLCで得られた各画分(F2-F16)を50μLに感染させた。rAAV1/2ベクターはCMVプロモーター(pAAV-CMV-ssGFP)の制御下で一本鎖緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードし、rAAV2/9ベクターは自己相補的GFPをコードするので、CMVプロモーター(pAAV-CMV-scGFP53)の制御下で、感染後48時間でこれらの細胞で直接GFP蛍光を調べた(補足図S6 および 補足図S7).RT-qPCR、クマシーブルー、およびウェスタンブロットの以前の観察結果と一致して、ウイルス画分F7およびF8で最も高い感染レベルが達成され、画分F9からF16で徐々に減少しました。

限外濾過および濃縮ステップ後にrAAVの生物学的活性が維持されるかどうかを確認するために、24ウェルプレートと8ウェルチャンバースライドの両方に播種したNeuro2A細胞に、CMVプロモーターの制御下でscGFPをコードする濃縮rAAV1/2ベクター(pAAV-CMV-scGFP53)を感染させた。明視野および蛍光画像は、感染後48時間で取得されました(より高解像度の画像については、図4A、B )。

より関連性が高く反射性のある細胞モデルで生成されたrAAVの感染能力を調査することを目的として、皮質からの半高密度の初代ニューロン培養物を12ウェルプレートに播種し、以前に使用したrAAV1 / 2-CMV-scGFPに感染させました。 固定細胞の標識に広く使用されているレクチンです。 図4C、D に示す画像は、Zeiss Axio Observer Z1とZeiss confocal LSM 710で取得されました。これらの図にGFPの直接蛍光で示されているように、濃縮モザイクウイルスは神経細胞の遺伝子導入特性を保持しています。

in vitroでモザイクrAAVを純度、物性、機能性の観点から特徴付けた後、次に、精製したrAAV1/2モザイクベクターを使用してC57BL/6マウスの小脳に形質導入する可能性を評価しました。そのために、9週齢のマウスに定位注射を行い、12週間後にGFP発現を評価しました。予想されたように、PBSを注射された動物は、GFP免疫標識時に蛍光を示さなかった。シナプシン1プロモーター(rAAV1/2-Syn-ssGFP)の制御下でGFPをコードするrAAV1/2ベクターを注入したマウスからの落射蛍光画像は、rAAV1/2ベクターが小脳のいくつかの領域、すなわち小脳深部核(DCN)領域、および小脳のさまざまな小葉をうまく形質導入することを明らかにしました(図5)。これらの結果は、哺乳類の脳における導入遺伝子の長期発現(12週間)を示しています。

rAAV生産ワークフロー:細胞プレーティング、トランスフェクション、精製、および分析方法の図。
図1:rAAVの生産と精製のプロトコルの概略図。rAAVは、ポリエチレンイミン(PEI)を使用したHEK293T細胞の一過性トランスフェクションによって産生されます。続いて、細胞を回収して溶解し、アフィニティークロマトグラフィーを介して細胞ホモジネートからrAAVを精製します。次に、rAAVを含む収集された画分を濃縮し、最終的なウイルスストックを力価、純度、形態学的特徴、および生物学的活性の観点から特徴付けます。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。PEI =ポリエチレンイミン;RT-qPCR = リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応。SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

UV吸光度グラフ、タンパク質分析ゲル、溶出結果を含むクロマトグラフィープロセス図。
図2:FPLC精製プロトコルとrAAV1/2の代表的な溶出プロファイル(A)rAAV精製プロセスのさまざまな段階を示す完全なクロマトグラムプロファイルの概略図。カラム平衡化ステップの後、サンプルを適用します。次に、カラムを洗浄し、NaClの濃度を上げて溶出を行います。未結合の物質(フロースルー)と溶出したウイルスの1mL画分を採取して分析します。280 nmでの吸光度はmAUで表され、x軸はmL単位の体積を示します。(B)rAAV1/2 溶出ピーク(黒)を示す拡大部分クロマトグラムと、対応するフラクション番号(F2-F16)および老廃液(赤で表示)。バッファーBの発行濃度と導電率(mS / cmで表される)も、それぞれ緑色と紫色で示されています。(C)アフィニティー精製(F2-F16)およびフロースルー中に収集された各画分のRT−qPCR。vg/μLの力価は対数スケールで表されます。(D)採取したウイルス画分のSDS-PAGE解析溶出ステップ(F2-F16)の各フラクションの等量(40 μL)とそれぞれのフロースルーをロードし、10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離しました。タンパク質バンドは、クマシーブルー染色によって視覚化されました。AAVキャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3に対応するバンドが示されています。標準タンパク質サイズのはしごは(L)と指定され、対応する分子量も示されます。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。RT-qPCR = リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応。SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

増幅、標準曲線、タンパク質ゲル、透過型電子顕微鏡、吸光度スペクトル、強度、力価分析。
図3:濃縮されたrAAV1/2ベクターの特性評価 (A)濃縮されたrAAV1/2サンプル(青色)、2 ×10 7 vg/μLから2 × 102 vg/μLまでの段階希釈標準試料(黒)およびテンプレートなしコントロール(緑色)の増幅曲線(緑)RT-qPCR中に得られた(B)rAAVサンプルの力価を決定するための標準曲線(線形回帰)(C)。)濃縮ウイルス粒子のSDS-PAGE解析。合計2.3×1010 vgの濃縮ストックをゲル上にプールした。(D)直径25~30nmのrAAV1/2粒子の透過型電子顕微鏡像。電子密度の高い中心を持つ空の粒子(黒い矢印で証明される)は、完全なカプシド(白い矢印で証明される)と区別できます。スケールバー = 100 nm。(E)Stunnerで測定したrAAV1/2製剤の吸光度スペクトル(黒)。タンパク質(青)、ssDNA(緑)、その他の紫外線吸収化合物または不純物(紫)、および背景の濁度(灰色)の寄与も示されています。(F)Stunnerで測定した、30nmに単一のピークを持つrAAV1 / 2のDLS強度分布。100%のカプシド散乱強度は、15〜45nm(網掛けされた緑色)の曲線下の面積を測定することによって決定されました。(G)総キャプシド力価が1.19 × 1014 cp/mL(濃い青)およびフルキャプシド力価が1.73 × 1013 vg/mL(濃い緑)を示すrAAV1/2ベクター調製物のスタナー解析。7.16 ×10 12 cp/mL当量(水色)の遊離および凝集タンパク質、ならびに1.04 ×10 12 vg/mL当量(薄緑)の遊離および凝集ssDNAも測定した。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。RT-qPCR = リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応。SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動;ssDNA = 一本鎖DNA;DLS = 動的光散乱。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

細胞の蛍光顕微鏡 GFP発現,DAPI染色,ウイルスベクター形質導入結果
図4:濃縮されたrAAV1/2サンプルの in vitro 感染性評価。 (A)Neuro2A細胞をrAAV1 / 2-CMV-scGFPに感染させるか、ネガティブコントロールとして同量のPBSとインキュベートしました。感染後48時間で画像化された細胞の明視野および蛍光画像。画像は、Zeiss Axio Observer Z1(10倍対物レンズ)で取得しました。スケールバー = 100 μm. (B) rAAV1/2 - CMV-scGFPによる感染後48時間のNeuro2A細胞の詳細画像。スケールバー = 20 μm. (C) rAAV1/2 - CMV-scGFPに感染した、または同量のPBSとインキュベートした半高密度の初代神経細胞培養物で、ネガティブコントロールとして作用する。細胞は、核染色(青のDAPI)と膜染色(白色のWGA)で標識しました。画像は、Zeiss Axio Observer Z1(40倍対物レンズ)で取得しました。スケールバー = 20 μm. (D) rAAV1/2 - CMV-scGFPによる感染後48時間の半高密度初代神経細胞培養の詳細な画像。スケールバー = 20 μm。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。CMV =サイトメガロウイルス;scGFP = 自己相補型緑色蛍光タンパク質;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;WGA = コムギ胚芽凝集素。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

脳切片の蛍光顕微鏡検査;DAPI、GFP染色、マージ画像は発現パターンを示します。
図5:実質内注射後のrAAV1/2の in vivo 形質導入効率。 小脳にrAAV1 / 2-Syn-ssGFPを中央注射すると、小脳全体に広がるGFP発現(緑色)を示す代表的な免疫蛍光画像。核はDAPI(青色)で染色しました。スケールバー = 500 μm。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。Syn = シナプシン 1;ssGFP = 一本鎖緑色蛍光タンパク質;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;PBS =リン酸緩衝生理食塩水。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

補足図S1:SmaIで消化したrAAVベクタープラスミドのアガロースゲル分析。 pITRの6つのクローン(C1-C6)を、SmaI制限酵素(レーン2、4、6、8、10、12)で消化しました。この場合、このpITRを完全に消化すると、2つのバンド(3,796 bpと3,013 bp)が生成されることが予想されます。調製が成功した場合(C1、C3、C4、C5)、部分消化に起因する6809 bpのバンドが依然として見られます(全体の~5%)。ITR組換えを用いた調製物では、比率が逆転するか(C2)、または消化が起こらなかった(C6)。それぞれの未消化クローンも提示される(レーン3、5、7、9、11、13)。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。ITR = 反転端子繰り返し。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:ヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィーによるrAAV2 / 9精製。 (A)NaCl濃度の増加に続いて、単一のピーク(黒色)を示すrAAV2/9の溶出プロファイル。収集された画分は、グラフの下部に赤の数字(2〜16)で示され、280 nmでの吸光度はmAUで表され、導電率はmS / cmで表され、x軸はmLで体積を示します。(B)各プール画分(F2-F16)およびフロースルーについてRT-qPCRによって定量されたrAAV力価。値は対数スケールで表されます。(C)SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色による純度アッセイ。各フラクション(F2-F16)の等量(40 μL)とそれぞれのフロースルーをロードし、10% SDS-PAGEで分離しました。濃縮ストックをRT-qPCRで定量し、2.3×1010 vgを40 μLのPBSで希釈し、ゲル上にプールしました。タンパク質バンドは、クマシーブルー染色によって視覚化されました。AAVキャプシドタンパク質(VP1、VP2、およびVP3)が示されています。標準タンパク質サイズのはしごは(L)で示され、対応する分子量も示されます。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。RT-qPCR = リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応。SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:FPLCで精製したrAAV1/2ベクターのウェスタンブロット解析。 (A)回収した画分と濃縮したrAAV1/2ベクターをSDS-PAGEゲル上で分離し、VP1、VP2、VP3のキャプシドタンパク質を認識するマウスモノクローナル抗AAV抗体(B1)でプローブした。(B)回収した画分と濃縮されたrAAV1/2ベクターをSDS-PAGEゲル上で分離し、VP1およびVP2キャプシドタンパク質を認識するマウスモノクローナル抗AAV抗体(A69)でプローブした。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。FPLC = 高速タンパク質液体クロマトグラフィー;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動;L =標準タンパク質サイズのはしご。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S4:FPLCで精製したrAAV2/9ベクターのウェスタンブロット解析。 (A)回収した画分と濃縮したrAAV2/9ベクターをSDS-PAGEゲル上で分離し、VP1、VP2、VP3のキャプシドタンパク質を認識するマウスモノクローナル抗AAV抗体(B1)でプローブした。(B)回収した画分と濃縮したrAAV2/9ベクターをSDS-PAGEゲル上で分離し、VP1およびVP2キャプシドタンパク質を認識するマウスモノクローナル抗AAV抗体(A69)でプローブした。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。FPLC = 高速タンパク質液体クロマトグラフィー;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動;L =標準タンパク質サイズのはしご。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S5:StunnerによるrAAV2/9ベクターの定量化と特性評価。 (A)Stunnerで測定したrAAV2/9ベクターの吸光度スペクトル(黒色)。タンパク質(青)、ssDNA(緑)、その他の紫外線吸収化合物または不純物(紫)、および背景の濁り(灰色)の寄与も示されています。(B)15〜45 nmの曲線下面積を測定することによって決定される、30 nmに主要なピークを持つrAAV2 / 9のDLS強度分布は、78%のカプシド散乱強度に対応します(網掛けの緑)。総凝集強度22%(灰色の網掛け)も測定され、平均直径620nmの大きな凝集体(19.9%)が主な寄与を示しました。(C)総カプシド力価が2.18 ×10 14 cp/mL(濃い青)および2.35 ×10 13 vg/mL(濃い緑色)の全カプシド力価を示すrAAV2/9ベクター調製物のスタナー分析。この調製物では、2.92 × 1013 cp/mL相当の遊離および凝集タンパク質(水色)、ならびに3.14 ×10 12 vg/mL相当の遊離および凝集ssDNA(薄緑色)も測定しました。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。ssDNA = 一本鎖DNA;DLS = 動的光散乱。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S6:rAAV1 / 2の精製画分の in vitro 形質導入効率と生存率。 ssGFP(rAAV1/2-CMV-ssGFP)をコードするrAAV1/2ベクターの50μLのFPLC画分で形質導入してから48時間後にGFP(直接蛍光)を発現するHEK293T細胞。スケールバー = 100 μm。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。FPLC = 高速タンパク質液体クロマトグラフィー;ssGFP = 一本鎖緑色蛍光タンパク質。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S7:rAAV2/9の精製画分の in vitro 形質導入効率と生存率。 HEK293T細胞に、CMVプロモーターの制御下で、各FPLC画分(F2-F16)またはscGFPをコードするrAAV2/9ベクターのフロースルーを50μLに感染させた。GFP発現細胞は、感染後48時間で可視化された。スケールバー = 100 μm。略語:rAAV =組換えアデノ随伴ウイルス。FPLC = 高速タンパク質液体クロマトグラフィー;scGFP = 自己相補型緑色蛍光タンパク質;CMV =サイトメガロウイルス。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

Disclosures

この原稿では、最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、アデノ随伴ウイルスベクターを生成および精製するための詳細なプロトコルについて説明します。シンプルでスケーラブル、かつ費用対効果の高いアプローチを提供し、超遠心分離の必要性を排除します。得られたベクターは、高い純度と生物学的活性を示し、前臨床試験でその価値を証明しています。

Acknowledgements

コインブラ臨床生物医学研究所(iCBR)および革新的生物医学バイオテクノロジーセンター(CIBB)のMónica Zuzarte博士がrAAVのTEM分析に関して提供してくれた協力、洞察、技術支援に感謝します。コインブラ大学神経科学・細胞生物学センター(CNC-UC)およびコインブラ大学学際研究所(IIIUC)のドミニク・フェルナンデス博士には、一次神経細胞培養実験に関する貴重な技術支援と洞察をいただき、感謝の意を表します。本研究に不可欠なpRV1、pH21、およびpFdelta6プラスミドは、アバディーン大学生命科学・医学部医科学部のクリスティーナ・マクルーア博士から寛大に提供され、感謝しています。この作業は、Centro 2020地域運用プログラムを通じて、欧州地域開発基金(ERDF)から資金提供を受けました。COMPETE 2020 - 競争力と国際化のための運用プログラム、およびFCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologiaを介したポルトガルの国家資金を通じて、プロジェクト:UIDB/04539/2020、UIDP/04539/2020、LA/P/0058/2020、ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095)、Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 |POCI-01-0145-FEDER-016807)、リセット-IDT-COP(CENTRO-01-0247-FEDER-070162)、ファイティングサース-CoV-2(CENTRO-01-01D2-FEDER-000002)、BDforMJD(CENTRO-01-0145-FEDER-181240)、ModelPolyQ2.0(CENTRO-01-0145-FEDER-181258)、MJDEDIT(CENTRO-01-0145-FEDER-181266);米国ポルトガル生物医学研究基金(APBRF)およびリチャード・チン・アンド・リリー・ロック・マチャド・ジョセフ病研究基金、IMI2 JUグラント契約に基づくARDATによる945473 EUおよびEFPIAの支援なし。GeneT-チーミングプロジェクトは101059981欧州連合のホライズンヨーロッパプログラムの支援を受けています。M.M.L.は 2021.05776.BD の支援を受けました。CHは 2021.06939.BD によってサポートされました。A.C.S.は 2020.07721.BD によって支援されました。D.D.L.は 2020.09668.BD によってサポートされ、 図1 は BioRender.com を使用して作成されました。

Materials

河BP17225 充填 充填塩化フィレンズを装備 を搭載した倒立共焦点顕微鏡
10% ポビドンヨードMedlineMDS093943
12-well platesThermo Scientific11889684
24-well platesVWR734-2325
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)InvitrogenD1306
96-well Stunner plateUnchained Labs701-2025rAAVサンプルの連続紫外可視光吸収、静的光散乱、動的光散乱解析用の96ウェル定量プレート
AAVpro 滴定キット(リアルタイムPCR用) Ver.2宝6233RT-qPCRによるAAVの力価測定用。このキットには、DNase I、Lysis Buffer、Dilution Buffer、ポジティブコントロール、Taq IIミックス、プライマーフォワード、プライマーリバース、水
酢酸氷Fisher ChemicalA / 0360 / PB17
Äが含まれています。KTA pure 25Cytiva29018224FPLCシステム、UNICORNソフトウェア、バージョン6.3 
アルカリホスファターゼ結合ヤギ 抗マウスInvitrogen31328
アミコン超0.5遠心フィルターユニットメルクミリポアUFC5100
アミコン超15遠心フィルターユニットメルクミリポアUFC9100
ベンゾナーゼヌクレアーゼメルクミリポアE1014
ブロモフェノールブルーシグマアルドリッチB0126
CFX96 リアルタイム PCR 解析システムBiorad184-5096
ChemiDoc Touch Imaging SystemBio-Rad Laboratories1708370
Chicken polyclonal anti-GFP Primary antibodyAbcamab13970
Coomassie Blue G250Fisher ChemicalC/P541/46
Dithiothreitol (DTT)Fisher Bioreagents
DMEMSigma-AldrichD5796
ECF Substrate for Western BlottingCytivaRPN5785
FastDigest SmaIThermo ScientificFD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit BiotwinFEIBiotwin透過型電子顕微鏡
ウシ胎児血清BiowestS1810
蛍光実装媒体ダコS3023
Formvar-carbon coated 200メッシュグリッド TAAB LaboratoriesEquipment F077/025
ガス排気装置RWDR546W
GlycerolFisher BioReagents10021083
Goat polyclonal anti-chicken anti-chicken anti-body, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3Hamilton7803-07
Hamiltonシリンジ(10 & マイクロ;L)Hamilton7653-01
HEK293TAmerican Type Culture CollectionCRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mLCytiva17040701済みヘパリンカラム
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mLCytiva17040601済みヘパリンカラム
Immobilon-P PVDF MembraneMerck MilliporeIPVH00010
イソフルランブラウン469860
ケタミン Dechra PharmaceuticalsN/ANimatek
低保持マイクロ遠心チューブ (2 mL)Fisher Scientific11906965
Lunatic &Stunner Client softwareUnchained LabsN/Aクライアント分析ソフトウェアバージョン 8.0.1.235。rAAVサンプルの連続的な紫外可視光吸収、静的光散乱、および動的光散乱分析のためのソフトウェア
メタノールフィッシャーケミカルM/4000/FP21
マウスモノクローナル抗AAV、VP1、VP2抗体 (A69)American Research Products03-61057
マウスモノクローナル抗AAV、VP1、VP2、VP3抗体 (B1)American Research Products03-61058
Neuro2aAmerican Type Culture CollectionCCL-131
正常ヤギ血清Gibco16210064
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-Nagel12738422
NZYColour Protein Marker IINZYtechMB09002
pAAV-CMV-scGFPAddgene32396Addgene plasmid # 32396;http://n2t.net/addgene:32396;RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFPAddgene105530Addgene プラスミド # 105530; http://n2t.net/addgene:105530;RRID:Addgene_105530
pAAV2/9nAddgene112865Addgene プラスミド # 112865; http://n2t.net/addgene:112865;RRID:Addgene_112865
パラホルムアルデヒドAcros Organics10342243
PBSFisher BioReagentsBP2438
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122
プルロニック F-68 非イオン性界面活性剤 (100x)Gibco24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000Polysciences Europe24765
R500シリーズコンパクト小動物麻酔器-イソフルランRWDN / A
サンプルインレットバルブV9-ISサイティバ29027746
サンプルポンプP9-SCytiva29027745
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS2002
ナトリウムッシャーサイエンティフィック10428420
デオキシコール酸ナトリウムSigma-AldrichD6750
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) Fisher BioreagentsBP166
滅菌 PVDF シリンジフィルターフィッシャーサイエンティフィック15191499
スタナープラットフォームUnchained Labs700-2002rAAVサンプルの連続的な紫外線吸収、静的光散乱、および動的光散乱分析のための機器
スーパーループ 150 mLCytiva18-1023-85
スーパーループ 50 mLCytiva18-1113-82
SURE 2 スーパーコンピテントセルStratagene, Agilent TechnologiesHPA200152
処理済み培養皿コーニング734-1711
トリスベースフィッシャーバイオ試薬BP152
トリス塩酸塩Fisher BioReagentsBP153
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633InvitrogenW21404
XylazineDechra PharmaceuticalsN/ASedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1Carl Zeiss MicroscopyGmbHN/A 倒立型蛍光顕微鏡 EC Plan-Neofluar 10x/0.30 対物レンズと Plan-Apochromat 40x/0.95 対物レンズ
Zeiss Axio Scan.Z1Carl Zeiss Microscopy GmbHN/Aスライドスキャナー蛍光顕微鏡 Plan-Apochromat 20x/0.8 対物
Zeiss LSM 710Carl Zeiss Microscopy GmbHN/APlan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC Objective
µ-Slide 8 well IbidiIbidi808268-well chamber slide

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