概要

マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

Published: July 26, 2024
doi:

概要

脳疾患に対する免疫応答を調べるために、免疫細胞の変化を解析するアプローチが一般的です。ここでは、マウスの脳組織と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するための2つの簡単で効果的なプロトコルが提供されています。

Abstract

脳の障害(脳虚血や自己免疫性脳脊髄炎など)によって引き起こされる免疫応答は、脳だけでなく頭蓋骨でも起こるという証拠が増えています。脳損傷(脳卒中など)後の脳と頭蓋骨骨髄の両方の免疫細胞集団の変化を解析するための重要なステップは、ダウンストリーム解析に十分な数の高品質の免疫細胞を取得することです。ここでは、脳と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するために、2つの最適化されたプロトコルが提供されています。両方のプロトコルの利点は、その簡便性、速度、および大量の生存免疫細胞の生成における有効性に反映されています。これらの細胞は、細胞ソーティング、フローサイトメトリー、トランスクリプトーム解析など、さまざまなダウンストリームアプリケーションに適している可能性があります。プロトコールの有効性を実証するために、フローサイトメトリー解析を用いて脳卒中脳と正常脳頭蓋骨髄のイムノフェノタイピング実験を行い、その結果は発表された研究結果と一致しました。

Introduction

神経系の中枢である脳は、頭蓋骨によって保護されています。頭蓋骨の下には、髄膜として知られる結合組織の3つの層(硬膜、くも膜、軟膜)があります。脳脊髄液(CSF)は、くも膜母と軟膜の間のくも膜下腔を循環し、脳を緩衝し、またリンパ系を介して老廃物を取り除きます1,2。このユニークなアーキテクチャは、脳の安定性を維持し、潜在的な損傷から脳を保護する安全で支援的な環境を提供します。

脳は長い間、免疫特権があると考えられてきました。しかし、実質に常在するミクログリアに加えて、脈絡叢や髄膜を含む脳の境界には多様な免疫細胞が宿主であるという証拠が増えているため、この概念は部分的に放棄されています3。これらの細胞は、恒常性の維持、脳の健康の監視、および脳損傷に対する免疫応答の開始に重要な役割を果たします。特に、最近の知見では、頭蓋骨が髄膜免疫に関与しており、損傷後の脳内の免疫応答に寄与している可能性が示されています。2018年、Herissonらは、頭蓋骨骨髄と髄膜をつなぐ直接的な血管チャネルの独創的な発見をし、それによって白血球の移動の解剖学的経路を確立しました4,5。その後、Cugurraらは、髄膜の多くの骨髄細胞(単球や好中球など)とB細胞が血液に由来しないことを実証しました6。著者らは、頭蓋骨骨移植や選択的照射レジメンなどの技術を用いて、頭蓋骨骨髄が髄膜の骨髄細胞の局所供給源として、また中枢神経系損傷後の中枢神経系実質の局所供給源として機能するという説得力のある証拠を提供した6。さらに、別の研究では、髄膜B細胞が頭蓋骨骨髄7によって常に供給されていることが提唱された。最近では、くも膜下カフ出口(ACE)と呼ばれる新しい構造が、免疫細胞の輸送のための硬膜と脳との間の直接のゲートウェイとして特定されています8

これらの興味深い知見は、損傷した脳への免疫細胞の浸潤の起源(虚血性脳卒中後など)に重要な意味を持っています。脳卒中後、多くの免疫細胞が脳に浸潤し、急性脳損傷と慢性脳回復の両方に寄与することが、多くの証拠で示されています。従来の考え方では、これらの細胞は血液中の白血球を循環させ、脳に浸潤していると考えられていましたが、これは主に脳卒中による血液脳関門の損傷によって促進されます。しかし、この概念は挑戦されています。ある研究では、マウスの頭蓋骨と脛骨の免疫細胞に異なる方法で標識され、脳卒中後6時間で、頭蓋骨好中球と単球の有意に大きな減少が見られました。脛骨、およびより多くの頭蓋骨由来の好中球が虚血性脳に存在していました。これらのデータは、急性脳卒中期において、虚血性脳の好中球は主に頭蓋骨骨髄に由来することを示唆しています4。興味深いことに、CSFはこの移行を導くかもしれません。実際、最近の2つの報告では、CSFが脳からのシグナル伝達の手がかりを頭蓋骨チャネルを介して頭蓋骨骨髄に直接中継し、CNS損傷後の頭蓋骨骨髄の細胞移動と造血を指示できることが示されました9,10

これらの最近の知見を踏まえて、脳疾患に対する免疫応答を研究する際には、脳と頭蓋骨骨髄の免疫細胞の変化を解析することが重要になってきています。このような研究では、細胞ソーティング、フローサイトメトリー解析、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)などのダウンストリーム解析に十分な数の高品質な免疫細胞が必要です。ここでは、全体的な目標は、脳組織と頭蓋骨骨髄から単一細胞懸濁液を調製するための 2 つの最適化された手順を提示することです。頭蓋骨の頭蓋骨(前頭骨、後頭骨、頭頂骨)は通常、骨髄の抽出に使用され、この骨髄は、この研究全体で特に頭蓋骨骨髄と呼ばれることに注意することが重要です。

Protocol

このプロトコルは、デューク研究所の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、雄のC57Bl/6マウス(生後3-4ヶ月;22-28g)を用いた。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。 1. マウス脳からのシングルセル懸濁液 注: 図1 は、脳細胞単離プロトコルの概要を示し…

Representative Results

マウス脳組織から免疫細胞を調製するために、プロトコルは一般に高い生存率(84.1%±2.3%[平均±SD])を有する細胞を産生する。これらの細胞の約70%〜80%はCD45陽性です。正常なマウスの脳では、予想通り、ほぼすべてのCD45+細胞がミクログリア(CD45LowCD11b+)です。このプロトコルは、フローサイトメトリー解析、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、scRNA-seq解析など、さまざま…

Discussion

ここでは、脳と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を分離するための2つのシンプルかつ効果的なプロトコルを紹介します。これらのプロトコルは、多様なダウンストリームアプリケーション、特にフローサイトメトリーに適した大量の生存免疫細胞を確実に生成できます。

様々な脳障害における神経炎症を研究するために、脳からの免疫細胞調製のための多くのプロトコルが確立?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kathy Gageの優れた編集貢献に感謝します。イラストフィギュアは BioRender.com で作成しました。この研究は、麻酔科(デューク大学医療センター)からの資金とNIHの助成金NS099590、HL157354、およびNS127163によって支援されました。

Materials

0.5 mL microcentrifuge tubes VWR 76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 76332-068
15 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle BD Biosciences 305195
1x HBSS Gibco 14175-095
50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339653
96-well V-bottom microplate  SARSTEDT 82.1583
AURORA  flow cytometer Cytek bioscience
BSA Fisher BP9706-100
CD11b-AF594 BioLegend 101254 1:500 dilution
CD19-BV785 BioLegend 115543 1:500 dilution
CD19-FITC BioLegend 115506 1:500 dilution
CD3-APC BioLegend 100312 1:500 dilution
CD3-PE BioLegend 100206 1:500 dilution
CD45-Alex 700 BioLegend 103128 1:500 dilution
CD45-BV421 Biolegend 103133 1:500 dilution
Cell Strainer 70 um Avantor 732-2758
Dressing Forceps  V. Mueller NL1410
EDTA Invitrogen 15575-038
Fc Block Biolegend 101320 1:100 dilution
Forceps Roboz RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific N7167 1:500 dilution
Ly6G-BV421 BioLegend 127628 1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5 BioLegend 127615 1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7 BioLegend 108723 1:500 dilution
Percoll (density gradient medium) Cytiva 17089101
Phosphate buffer saline (10x) Gibco 70011-044
RBC Lysis Buffer (10x) BioLegend 420302
Scissors SKLAR 64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size DWK Life Sciences 357544

参考文献

  1. Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987 (2022).
  2. Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
  3. Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain’s borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
  4. Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
  5. Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
  6. Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), eabf7844 (2021).
  7. Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), eabf9277 (2021).
  8. Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
  9. Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
  10. Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
  11. Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340 (2023).
  12. Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142 (2021).
  13. Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).
  14. Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
  15. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. 108, e53658 (2016).
  16. Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods’ evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976 (2022).
  17. Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. 159, e61166 (2020).
  18. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  19. Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948 (2021).
  20. Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125 (2023).
  21. Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272 (2023).
  22. Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119 (2023).
  23. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50 (2018).

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記事を引用
Zhang, R., Zhang, J., Rehman, A. U., Dang, L., Yu, X., Yang, W. Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull. J. Vis. Exp. (209), e66861, doi:10.3791/66861 (2024).

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