植物寄生性線虫によるジャガイモ根のin vivoおよびin vitro感染による植物寄生性線虫の感染

根菜類と塊茎作物は、世界で最も重要な主食の中で4^位にランクされています。ジャガイモ(Solanum tuberosum L.)は、最も重要な栽培塊茎の1つです。南アメリカのアンデス山脈に起源がありましたが、16^世紀にヨーロッパに導入された後、すぐに低所得の人々にとって最も一般的な食料源になりました。今日、ジャガイモは世界のカロリー摂取量の1.7%を占めています¹。作物の生産は、植物の害虫や病原体の影響を強く受けており、そのうち植物寄生性線虫(PPN)は平均収量損失を最大12^%2引き起こす可能性があります2。植物寄生性線虫は、現代農業における作物に最も有害な病気のいくつかの原因となっています。土壌に生息するPPNは、植物の根に影響を与え、生産を減らしたり、製品を傷つけたりして作物の生産性を妨げ、市場性を失うため、農家に大きな損失を課します³。これらの危険な植物寄生虫は、スタイレット(針のような口器)を使用して根細胞に穴を開け、細胞の内容物を食べます。一部のPPNは根の外部から供給し、他のものは根に入り込んで組織損傷(回遊性)を引き起こしますが、他のPPNは根に入り込んで座りがちになり、摂食を容易にするために根の構造が大きく変化します⁴。ジャガイモに影響を与える主なPPNは、ジャガイモシストセンチュウ、Globodera属、ネコブセンチュウ(RKN)、Meloidogyne属、根病変線虫、Pratylenchus属、偽ネコブセンチュウNacobbus aberrans、およびジャガイモ腐朽線虫Ditylenchus destructorです。これらのPPNでは、摂食習慣が異なれば、宿主の根組織に異なる構造変化が誘発されます^5,6。PPN感染と宿主応答のメカニズムに関する研究は、参照PPN培養コレクションを維持したり、大規模な実験を行ったりするために、野外試験や温室試験を通じて行われることが多い^7,8。自然条件下での試験は、環境の変化や生物的または非生物的なストレス要因の影響を強く受けます。温室バイオアッセイは、環境変動の相対的な制御を可能にし、非生物的および生物的ストレスの影響を制限しながら、自然条件に近い代替手段です。しかし、宿主の遺伝的多様性は、生物学的多様性をより細かく制御する必要がある試験では、依然として課題となる可能性があります。これらの制限は、in vitro植物組織培養に頼ることで克服できます。これらは、PPNs疾患研究に多くの利点を持つ汎用性の高いラボシステムです。土壌に生息するPPNの場合、トランスジェニック根のin vitro培養は、実験室条件での研究に有用なツールです^9,10。

トランスジェニック根、または毛むくじゃらの根(HR)は、植物材料にRhizobium rhizogenesを感染させた後に得られる(Riker et al. 1930) Young et al. 2001¹¹.このグラム陰性菌は、そのRiプラスミドの宿主ゲノムへのトランスフェクションを誘導し、植物ホルモンの生合成の調節を変化させ、根組織の形成を促進する¹²。トランスジェニック根は、培地中の無菌下で無期限に維持できます。PPNの研究にHRを使用する利点は、線虫の感染と発生に影響を与える植物成長調節因子がない場合で高い成長率、単位時間あたりのバイオマス生産の比率が高いこと、およびより高い遺伝的および生化学的安定性を決定する細胞の完全性と寿命です⁶。in vitroトランスジェニックルートに頼ることにより、PPNの遺伝子型を実験室条件下で無期限に維持することができ、感染およびPPNの進行を容易に追跡することができ、宿主の遺伝的変動性を減らすことができ、宿主の分子構成の操作を線虫の応答に直接関連付けることができ、宿主および寄生虫の構造変化をより正確に追跡することができる^6,13。ジャガイモのPPN疾患に関する研究では、in vitroトランスジェニック根共培養により、季節やジャガイモ塊茎の休眠とは無関係に実験を行うことができます。

このプロトコルでは、ジャガイモ植物のPPN維持と in vivo 感染の従来の方法論が詳細に説明されています。感染した根の構造解析では、PPNを含むトランスジェニックジャガイモ根の in vitro 共培養の確立に基づく改良された方法論も、環境および宿主の遺伝的多様性をより高度に制御できる代替手段として詳述されています。根組織におけるPPNの感染と発生を追跡するために、光学顕微鏡下でのPPN観察を支援するために組織化学が用いられます。このプロトコルの全体的な目的は、PPNと宿主の相互作用の研究を最適化し、実験のためのより制御された再現性のある条件を確保しながら、根組織内の線虫の詳細な構造的および発生的分析を容易にすることです。

1. 温室栽培のジャガイモの感染

注:温室試験は、PPN害虫の特定のライフサイクルに応じて、混合ライフステージまたは第2段階の幼体(J2)でPPNの懸濁液を使用して行われます。このプロトコルでは、根病変線虫(RLN) Pratylenchus penetrans の混合ライフステージの懸濁液を使用した。PPNは、ラボで飼育することも、認定リファレンスラボに依頼することもできます。

1. 根病変線虫の増殖と維持
   注:滅菌されたニンジンディスクは、RLNの増殖と維持に使用されます¹⁴.市販のにんじん(Nice)は、目に見える損傷がなく、微生物汚染を減らすために使用してください。できれば、RLNの発達を妨げないように、農薬を含まない必要があります。
   1. にんじんを水道水で洗って大きな破片を取り除き、その後、一般的な洗剤溶液(水40mLあたり1滴)で細かい破片を取り除きます。実験用ペーパータオルで乾かします。
   2. 無菌下では、垂直フローフードに、ニンジンの上部(内側1〜2 cm)に滅菌した金属製の串を挿入して、より簡単に保持できるようにします。
   3. ノズル付きのウォッシュボトルを使用して、にんじんを96%(v / v)エタノールで濡らします。にんじんの底の先端を滅菌した濾紙で拭き取り、慎重に炎にかけます。
      注意:エタノールは強く発火するので、距離を置いて立ってください。
   4. 滅菌ピーラーを使用してにんじんを上から下に皮をむき、前の手順を繰り返します。上部と下部(内側2 cm)を捨て、にんじんの中央部分を滅菌ペトリ皿(直径150 mm)に入れます。滅菌刃とピンセットを使用して、にんじんの直径約2cmの部分から厚さ1cmの部分を慎重に切り取ります(図1)。
   5. 切片を滅菌ペトリ皿(直径60mm)に移し、透明フィルムで縁を密封します。UVライトを使用して、にんじんディスクの表面を両側で60分間滅菌します。
   6. 暗闇の中で25°Cに1〜2週間保管し、微生物汚染の兆候を示し始めたニンジンディスクを廃棄します¹⁵。
      注意: 目に見える汚染の兆候は、過度の褐変(腐敗)、ニンジンディスクの下縁への液体の蓄積、または表面での真菌菌糸体の成長です。
   7. 残りのニンジンディスクは、RLN懸濁液に感染する準備ができています。滅菌ブレードを使用して、にんじんディスクの中央にX字型の切開を行うことから始めます。半分だけ深く切るようにしてください。
   8. X字型創傷の中心に少なくとも50の混合ライフステージを含む懸濁液を50μLピペッティングしてRLNを接種します。ペトリ皿を閉じ、乾燥を防ぐために透明なフィルムで境界を密封します。
      1. 凹型スライド内の室温で双眼実体顕微鏡(40x)で50μLアリコートを5つカウントすることにより、懸濁液中の線虫の平均数を決定します。混合ライフステージのRLNの懸濁液を1mLあたり1000個に設定するには、懸濁液に水を加えるか、線虫が沈降するのを待ち(約60分)、表層水をデカントして容量を下げます。
   9. にんじんの円盤を25°Cの暗闇で最大3か月間保持し、双眼実体顕微鏡で毎週追跡して、RLN人口の増加に起因する壊死性病変の兆候を確認します。
      注:正常に寄生されたニンジンディスクは、後で最大2か月間使用するために11°Cで保存できますが、微生物汚染がないか定期的にチェックしてください。微生物感染の兆候を示す寄生ニンジンディスクは、廃棄する前にオートクレーブで除染する必要があります。
   10. フローフードの下で、接種部位に組織壊死が見えるニンジンディスク(図1)を、滅菌ガラスボウルにセットした直径8cm、メッシュ75μmのふるいに移すことにより、RLNを抽出します。ふるいの底とボウルの凹みとの間に小さな1cmの隙間を空けて、RLNを収集します。
       注:市販のふるいがない場合は、直径8cmのプラスチックチューブ/頑丈なプラスチックカップ、およびタイトなメッシュガーゼから作ることができます。輪ゴムを使用して、ガーゼをプラスチックチューブまたはカップに固定します。
   11. にんじんの円盤が覆われるまで抗生物質溶液をふるいに注ぎ、暗闇の中で12時間(一晩)保管します。RLNはニンジンディスクから出て、ボウルの底に沈殿します。抗生物質溶液は、滅菌蒸留水¹⁶にカナマイシンとカルベニシリンのそれぞれ50μg / mLを添加することにより、抽出とともに即座に調製する必要があります。
       注:抗生物質ストック溶液は、0.5 gのカナマイシン一硫酸塩または0.5 gのカルベニシリン二ナトリウムをそれぞれ10 mLの滅菌蒸留水に溶解することにより、50 mg / mLで調製されます。.ストック溶液はフローフード内でろ過(0.22 μmメッシュ)され、-20°Cで最大1年間保持できます。
   12. ふるいを取り出し、滅菌したガラスピペットを使用して、ボウルの底からRLNを滅菌したガラス染色ブロック(4 cm x 4 cm x 1 cm)に引き込み、1 mLの抗生物質溶液をピペッティングして洗浄します。線虫が落ち着くまで30〜40分待ってから、使用済みの抗生物質溶液を収集します。この洗浄を4〜5回繰り返します。
   13. 水懸濁液をRLNと一緒にすぐに使用するか、11°Cで長期間(最大2か月)保管してください。
2. ジャガイモ植物のPPNによる生体内感染
   注:影響を受けやすいジャガイモ植物(S. tuberosum var. Désirée)を栽培するには、1月から3月の間に農産物販売業者から認証された種芋を入手する必要があります。認証された種芋を選ぶのは、植物検疫パスポートが付いており、検疫植物寄生虫に汚染されていないことを確認するためです。予防策として、10%漂白剤溶液で消毒し、続いて水道水で洗浄する最初のステップを実行して、ジャガイモ塊茎の表面を確実に消毒することができます。一般的な商品化されたジャガイモは、発芽と活力を減らすために課せられた治療がジャガイモの成長と感染への反応を妨げる可能性があるため、推奨されません。
   1. 同じサイズのジャガイモ塊茎を選択し、穴、あざ、または柔らかい部分のあるものは捨てます。播種する前に、成長したすべての芽(1 mm)をそっと取り除き、発芽を同期させます。
      注意: 必要に応じて、播種する前に、種芋を換気の良い、乾燥した、暗い場所に保管してください。
   2. 5つのLポット(22 cm x 18 cm)に、オートクレーブ処理した土壌と細かい粗砂を1:1で混合し、22.5 gの徐放性NPK肥料(12-12-12)を混ぜたもので満たし、ジャガイモを土壌表面から9cm下に播種します。
      注:土壌と砂をふるいにかけ、2 mmを超える破片を取り除き、121°Cで15分間2回オートクレーブ滅菌し、100°Cで1〜2日間乾燥させ、頻繁に混合する必要があります。使用前に、頻繁に混合して次の7〜10日間通気します。
   3. 鉢を温室に保管し、湿度の高い条件(湿度50%〜70%)で頻繁に水をやります(土壌を最大保水能力の70%に保ちます)極端な温度を避け、ジャガイモの芽が土壌表面に現れ始めるまで。
   4. 植物が出現した後、新しく抽出したRLN懸濁液を使用してジャガイモの根に感染させます。まず、植物の周りに4〜6個の穴(幅1 cm)を播種の深さまで均等に分散させます。
   5. 30,000の生きた混合ライフステージのRLNの8 mL懸濁液を穴に均等にピペットで移し、接種物が土壌混合物のgあたり4つの生きたRLNの比率になるようにし、土壌混合物で覆います。RLNを含む鉢の場合、接種当日は水やりを控えてください。
      注:RLNは実体顕微鏡(40倍)でカウントされます。死んだ線虫は非運動性で伸びた形をしていますが、生きている線虫は一般的に動いています(伸びていない形)。物理的な突っ込みは、死亡率を確認するために使用されます。
   6. 上記の条件下でポットを2か月間保管します(図2)。その後、ジャガイモの植物を根こそぎにし、芽と根を別々に量ります。
   7. 染色技術を使用してRLN攻撃部位の位置を確認する前に、根系を注意深く洗浄します⁵。

2. ジャガイモのトランスジェニック根とPPNsのin vitro共培養法の確立

1. 確立 in vitro ジャガイモのトランスジェニック根
   注:このプロトコルでは、 Rhizobium rhizogenes を運ぶ gus Riプラスミドに共共和解し、ダブル35Sプロモーター(A4pRiA4::70GUS)によって駆動されるレポーター遺伝子¹⁷.細菌は、市販の供給源から入手することも、認定された参照ラボから依頼することもできます。
   1. 指数関数的増殖期に細菌を得るためには、 R. rhizogenes をLuria-Bertani (LB)¹⁸ 固体培地プレートに広げ、26°Cで一晩放置します。
      注:LB培地は、市販または実験室で調製するために、10 g/Lペプトン、5 g/L酵母抽出物、10 g/L NaCl、および15 g/L寒天を添加し、121°Cで15分間蒸気滅菌します。
   2. 接種ループを使用して、コロニーを選び、滅菌済みの50 mLフラスコに10 mLの液体LBブロス(寒天なしのLB培地)を接種します。攪拌(180 rpm)下で26°Cの暗闇で一晩保管します。
   3. A₆₀₀ が0.6に達するまで、液体培養物の吸光度を測定します。この段階では、バクテリアは指数関数的な成長段階にあり、植物材料の接種に使用されます。
   4. 接種は無菌の新鮮なジャガイモ塊茎で行われます。ジャガイモ塊茎の表面を滅菌するには、まず流水で水道水で洗って大きな破片を取り除き、次に一般的な洗剤溶液(水40 mLあたり1滴)で激しく攪拌して、細かい破片を取り除きます。
      注:使用中のPPNに対する感受性が知られているジャガイモの品種を選択してください。このプロトコルには、 S. tuberosum var. Désiréeを使用しました。
   5. 塊茎を容器に入れ、市販の漂白剤溶液(1:4、水道水に市販の漂白剤)で覆い、閉じます。15分間混合し、漂白剤溶液を廃棄し、滅菌した水道水で3回すすいでください。
   6. フローフードで、塊茎をエタノール溶液(80%、v / v)に15分間激しく攪拌しながら浸し、エタノールを処分し、滅菌した水道水で3回すすいでください。
   7. 滅菌メスを使用して、塊茎の周辺部分(塊茎の表面から内側に向かって約50%)を取り除き、内側の中央片を厚さ0.5cmのセグメント¹⁹に分割する。ステップ2.1.3で調製した細菌懸濁液を直ちに接種します。
   8. 接種するには、pH = 5.6で30 g / Lのスクロースを補充した9 mLのシェンクおよびヒルデブラント²⁰ (SH)培地に1 mLの細菌懸濁液を加えて、細菌懸濁液を希釈します。滅菌メスの先端を希釈した懸濁液に浸し、ジャガイモセグメントの表面を巻きます。この手順をジャガイモのセグメントごとに5回繰り返します。
   9. 過剰な湿度の部分を滅菌濾紙で1分間乾燥させ、半固体のSH培地(ショ糖30 g/L、寒天8 g/L、pH = 5.6のSH培地)に入れ、プラスミドトランスフェクションが行われるまで25°Cの暗所に保管します。
   10. 3日後、感染したセグメントを、抗生物質のセフォタキシムとカルベニシリンのそれぞれ150μg / mLを補給した半固体SH培地のプレートに移します。.バクテリアを確実に除去するために、毎週の培地の更新で3か月以上保管してください。
       注:セフォタキシムストック溶液は、1 gのセフォタキシムナトリウムを10 mLの滅菌脱塩水に溶解し、フローフードの下でろ過(0.22 μmメッシュ)することにより、100 mg / mLで調製できます。抗生物質は-20°Cで最大1年間保持できます。
   11. 3か月後、トランスジェニック根の成長は広範囲に及びます。抗生物質を含まない新鮮な半固体のSH培地に根を移すには、滅菌ピンセットの先端で1 gの根の塊を集め、新しいプレートの培地の中央に置きます(図3)。
       注:感染後約1ヶ月で、細胞増殖の小さな塊がジャガイモセグメントの表面に現れ、そこからトランスジェニック根が発達し始めます⁶。それらを培地と接触させておくようにしてください、さもなければ彼らは乾燥する可能性があります。
   12. 遺伝的および代謝的安定性を確保するため、トランスジェニック根を毎月のサブカルチャールーチン(ステップ2.1.11で説明)の下に置き、25°Cの暗闇で1年以上放置してから、PPNに感染させます。
       注:望ましくない微生物汚染が頻繁に発生するため、プロトコルの各ステップで少なくとも6回の複製が保持されていることを確認してください。一度確立されると、単一の共培養プレートをいくつかの新しい共培養の接種材料として使用できます。ただし、少なくとも6枚の複製プレートを保管してください。
2. PPNを用いたトランスジェニックジャガイモ根の in vitro 共培養法の確立
   注:トランスジェニック根とPPNとの共培養を得るためには、線虫の滅菌プロセスが重要です。現在のプロトコルでは、検疫ネコブセンチュウ Meloidogyne chitwoodiの第2段階の幼体を使用しました。線虫接種物は、根こぶの形で認定された参照実験室から入手できます。
   1. 双眼実体顕微鏡(20倍)下で、滅菌済みの超微細ピンセットで根のこぶから線虫の卵塊を分離します。5 mLの滅菌水道水を入れた蓋付きのシャーレに卵塊を入れ、卵を48時間孵化させます。J2懸濁液を1mLあたり100センチュウに設定します。
   2. フローフードで、500 J2を含む懸濁液5 mLを滅菌20 μmメッシュの滅菌ふるいにピペットで移し、滅菌水道水で洗浄します。
   3. J2sを含むふるいの下半分を20%過酸化水素(H₂O₂)溶液に浸し、手動で円を描くように15分間混合します。
   4. 滅菌されたJ2をふるいを通して滅菌水道水を分注して洗浄します。この手順を3回繰り返します。最後の洗浄では、線虫がふるいの境界に集まるようにふるいを傾けます。滅菌線虫懸濁液をふるい境界に1mLの滅菌超純水をピペッティングして回収し、11°Cで保存するか、すぐに使用してください。
      注:滅菌の成功は、線虫懸濁液の100μLアリコートをSH培地に播種し、汚染がないか1週間定期的に監視することで評価できます。
   5. フローフードで、1gのジャガイモトランスジェニック根の塊(ステップ2.1.11に記載)を、100個の滅菌線虫(100μLの懸濁液、1000J2s/mL)を含むSHプレート上に継代培養します。2〜3週間後、新しい根に小さなこぶが現れ始めます。
   6. 倒立顕微鏡(100倍)で定期的に共培養を追跡し、卵塊が目立ち始めたら、新しい半固体SH培地プレートに継代培養し、根の塊でこぶが採取されていることを確認します(図4)。共培養は、暗闇の中で25°Cの毎月のサブカルチャールーチンの下に保ちます。

3. PPNs感染の構造解析

注:PPNによって誘発される根組織構造の変化を追跡するために、組織化学的染色技術を使用して、異なる化学組成の組織を対比します。鑑別染色は、根の塊または固定された根材料の薄い切片で行われ、特定の色素がそれらの化学的親和性に従って標的組織と反応する²¹。現在のプロトコールでは、酸性フクシン、または過ヨウ素酸シフ試薬(PAS)とトルイジンブルーO色素を組み合わせて鑑別染色に使用しました。

1. 酸性フクシンで染色した根の植物寄生性線虫の分布
   注:根系全体にわたるPPNの分布を追跡するために、酸性フクシンを使用して線虫の筋肉組織を赤い色合い5に染色^します。
   1. まず、水道水で根系を5分間洗浄し、土壌の破片(in vivo 植物の根)または培地の残留物(in vitro トランスジェニック根)を取り除きます。指を円を描くように動かして、根系から土を切り離すのを助けます。
   2. 根系を1〜2 cmの長さのセクションに切り、150mLのビーカーの中に置きます。1.5 % 次亜塩素酸ナトリウム (NaOCl) 溶液 70 mL を分注し、4 分間激しく混合して根組織を透明にします。その後、NaOCl溶液を廃棄し、流水で根をすすぎ、脱塩水に15分間浸して残留NaOCl²²を除去します。
      注:塩素系漂白剤には最低5.25%のNaOClが含まれているため、50mLの水に20mLの塩素系漂白剤を加えて1.5%のNaOCl溶液を得ます。より柔らかい材料(例えば、若い根または in vitro で成長したトランスジェニック根の柔らかい組織)には0.9%のNaOCl溶液を使用し、より硬い材料(古い木化した根)には2.0%のNaOCl溶液を使用します。
   3. きれいにした根を水気を切り、30mLの脱塩水を入れたホウケイ酸ガラスビーカーに置きます。1mLの酸性フクシン染色液をピペットで取り、手動で混合し、ホットプレートで30秒間煮沸します。ガラスビーカーを冷まし、溶液を排出し、汚れた根を水道水で洗います。
      注:酸性フクシン染色液は、3.5 gの酸性フクシン染料粉末を250 mLの酢酸に溶解し、750 mLの脱塩水を加えて調製します。染色に続いて、未使用の余分な汚れを取り除き、標本のコントラストを高めるための脱染ステップが常に行われます。
   4. 数滴のHCl(5N)¹³で酸性化したグリセリン10〜30mLを加えて染色します。
   5. 実体顕微鏡または倒立顕微鏡で観察し、PPNが根構造のどこで優先的に攻撃しているかを大まかに評価します(図5 および 図6)。
2. 過ヨウ素酸-シッフ(PAS)/トルイジンブルーOによる根細胞形態の評価
   注:PPNs感染の影響または根細胞形態への損傷は、最初に感染したジャガイモの根を固定し、切片化し、鑑別染色することにより、顕微鏡下で評価できます。
   1. 閉じたサンプルバイアルで、新鮮な根の材料を2.5%グルタルアルデヒドで調製し、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液で調製し、pH 7.2で、室温⁶で24〜48時間固定します。
      注意:グルタルアルデヒドは有毒です。吸入や接触を避けてください。保護用の白衣と手袋を使用し、ドラフトで作業してください。サンプルバイアルは、すすぎまたは真空手順でない限り、閉じる必要があります。グルタルアルデヒドは、有害廃棄物手順の規則に従って廃棄してください。ステップ3.2.1から3.2.5は、試薬の吸入を避けるためにヒュームフードで実行されます。
      注:1 Lのリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)を調製するには、68.4 mLの1M Na₂HPO₄ (1 L溶液中141.96 g)を31.6 mLの1M NaH₂PO₄ (1 L溶液中119.98 g)に加え、900 mLの脱塩水を加えて1 Lまで充填します。固定液の浸潤を助けるために、キャップされていないサンプルバイアルを根材入りの低真空(26 mm Hg)下に2分間、真空ポンプに接続されたデシケーターに入れます。
   2. ガラス製のパスツールピペットで、固定液を捨て、固定根をリン酸ナトリウム緩衝液(3x)で洗浄します。
   3. 緩衝液を10%エタノール溶液(v / v)に15分間交換することにより、固定根組織を徐々に脱水し始めます。その後、ガラスピペットを使用して20%エタノール溶液と交換し、根を15分間埋め込んだままにします。エタノール濃度の増加(30%、40%、50%、60%、70%、80%、および90%をそれぞれ15分間)段階的に連続して、根を1時間保持する必要がある純粋なエタノールステップまで続けます。
   4. 脱水した根を樹脂(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)に徐々に埋め込みます。ガラスピペットを使用して、純粋なエタノールを3:1(v / v)のエタノール/樹脂溶液と交換し、4°Cで24時間保持します。 これに続いて、1:1および1:3(v / v)のエタノール/樹脂溶液をそれぞれ4°Cで24時間のインキュベーション期間で使用します。 その後、1:3(v / v)溶液を、重合開始剤として過酸化ジベンゾイル(1%)を添加した純粋な樹脂に置き換えます。
   5. サンプルを樹脂モールドトレイにセットし、樹脂:ジメチルスルホキシド15:1(v / v)混合物を追加し、ホットプレート上で60°Cに48時間保持して樹脂を硬化させます。
   6. 含浸したサンプルをタングステンナイフを装備した回転式ミクロトームにセットし、メーカーの指示に従ってスライドガラス上に2〜5μmの切片をスライスします。
   7. 示差染色を開始するには、スライドを酢酸中の15%2,4-ジニトロフェニルヒドラジン溶液を含むガラス染色ジャーに室温で10分間浸します。その後、水道水で15分間注意深く洗い、60°C(15分)のオーブンで乾燥させます。
   8. 続いて、スライドを過ヨウ素酸(1%)に10分間浸し、水道水で5分間洗浄し、60°Cのオーブン(15分)で乾燥させます。
   9. スライドをシフ試薬(1%パラロサニリンと4%メタ重亜硫酸ナトリウム、0.25 M塩酸に含む)に30分間浸漬します。その後、塩酸(0.05 M)中のメタ重亜硫酸ナトリウム溶液(0.5%)で2分間洗浄し、3回繰り返します。最後に水道水で5分間洗い、室温で乾燥させます。
   10. コントラストとして、スライドを0.05%トルイジンブルーOに15分間浸し、水道水で15分間洗浄し、60°Cのオーブンで乾燥させて染色します(15分間)。
   11. 画像キャプチャハードウェアを搭載した顕微鏡(100倍)で観察します(図7)。

ニンジンディスクは、いくつかの種類の渡り性PPNを増殖させ、維持するために使用できる23。RLNの場合、この手法は一般に、線虫種または分離株の参照コレクションを維持するために使用されます。ニンジンディスクを使用すると、3か月の期間で線虫の個体数が平均100倍に増加する可能性があります(図1)。しかし、線虫の数は大きく異なり(30倍から200倍の間)、主に線虫の遺伝的多様性および/またはニンジンの栄養成分の変動によるものです。また、微生物汚染を減らすためにいくつかの予防策が講じられているにもかかわらず、にんじんの円盤の20〜30%が汚染される可能性があるため、必要以上のプレートを準備するようにしてください。

ジャガイモ植物では、RLNは根系を攻撃する寄生虫の個体数に大きく依存するため、RLNの存在が必ずしも目に見える症状を引き起こすわけではありません(図2)。 P. penetransの場合、4 RLNs/gの土壌を最初に接種すると、2か月後に最大2000 RLNs/gの根と750卵/gの根を蓄積でき、根の重量が約30%減少します5。

ジャガイモの毛むくじゃら根培養は、実験室で根関連疾患を研究するためのハイスループットシステムです。確立されたジャガイモのトランスジェニック根の比成長率は、SH培地1リットルあたり1日あたり300 mgの根新鮮重量で、倍増時間は2.6日です6(図3)。M. chitwoodiと共培養すると、線虫が根の組織を食べてエネルギーの吸収源を引き起こすため、これらのパラメータはわずかに影響を受けます。共培養では、SH培地1リットル当たり1日当たり200mgの根新鮮重量の比成長率と3日の倍増時間を達成することができる6。発育する線虫の数は、ジャガイモのトランスジェニック根の新鮮重量のgあたり最大1200 J2sまで上昇する可能性があり、卵の量は4倍高くなる可能性があります6,13(図4)。温室栽培のRKN感染トマト植物の土壌での試験と比較すると、線虫集団の最高収量は、根材料1gあたりのトランスジェニック根の半分に過ぎませんでした(未発表データ)。しかし、RKNの個体数の増加は、宿主植物の種や品種に大きく依存することが知られています。それにもかかわらず、形態学的には、トランスジェニック根で飼育された線虫は、野外または温室感染から回収されたものと実質的な違いは示さない6,13。

酸性フクシンの使用は、根組織への線虫の攻撃を追跡するのに役立ちます。RLNの運動段階は、接種後1日で根の内部に見られることが知られている5。この初期段階は、宿主の感受性に依存しないと考えられています。しかし、浸透後、RLNは根の表皮細胞と皮質細胞を食べ続けるか、感受性植物で壊死の形成を繁殖して誘発するか、根から土壌に戻る5。これらのメカニズムは、酸性フクシンで染色することで簡単に追跡できます(図5)。ジャガイモの毛むくじゃらの根とRKNの共培養は、座りがちな成体女性の摂食場所の確立におけるJ2浸透と意思決定のメカニズムを分析するための強力な実験ツールを提供します。ゼラチン状マトリックスの形成や卵子の放出など、感染後のすべての段階を追跡できます(図6)。

組織構造は、組織化学および光学顕微鏡を用いて詳細に説明することができます。鑑別染色技術を使用すると、植物寄生虫のライフサイクル段階を、周囲の根組織に誘発される変化とともに追跡できます。 Meloidogyne chitwoodiは、 他のネコブセンチュウと同様に、巨大細胞と呼ばれる特定の細胞タイプで構成される摂食部位の形成を促進します。これらの多核細胞は、線虫J2からの分泌物によって誘導され、代謝的に過剰に活性化し、静止した成体女性のための食物を産生します(図7)。この特殊な構造の形成に続いて、線虫の摂食メカニズムに関する重要な情報を提供し、そのライフサイクルの混乱を標的とすることができる特定のステップの特定を可能にします。また、摂食部位の構造はRKN種に特異的であり得、その同定に寄与する。

図1:ニンジンディスクの根病変線虫の維持(A)ニンジンの根のディスクは滅菌され、Pratylenchus penetransに感染し、(B)特徴的な壊死性病変(暗い部分)を引き起こします(C)人口増加。バー= 1 cm(AおよびB)、100μm(C)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:温室条件で栽培された Solanum tuberosum の根の感染。 対照ジャガイモ植物(奥の鉢)と根病変線虫に感染した植物(手前の鉢)は、感染30日後に新芽に感染の目に見える症状を示さなかった。バー= 10 cm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: Solanum tuberosum トランスジェニック根の発達。 (A)小さな細胞増殖塊がジャガイモ塊茎部分のメス傷領域に沿って現れ始め(矢印)、(B)続いて最初のトランスジェニック根(右側挿入)が出現し、(C)培養培地中で急速に成長し維持します。(D)根の塊を新鮮な培地プレートに移して、継続的に成長させることができます。バー= 1 cm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4: Solanum tuberosum と植物寄生性線虫 Meloidogyne chitwoodiとの共培養 (A) In vitroでは、ジャガイモのトランスジェニック根培養物を(B)コロンビアネコブセンチュウ無菌第2期幼体(J2)に感染させて、植物/線虫の共培養を確立することができる。(C)根のこぶは、卵塊を持つ成体の女性で取得できます。バー= 1 cm(A、B)および200 μm(C)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:温室条件下で根病変線虫Pratylenchus penetransに感染したジャガイモの酸性フクシン染色根(A)線虫のいくつかのライフステージは、(B)壊死性病変を引き起こす根の皮質領域に見られます。バー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:Meloidogyne chitwoodiに感染したトランスジェニック根からの酸性フクシン染色根の根こぶ(A)胆汁組織が見られ、(B)すでに卵塊(D)を卵と一緒に生成した成虫の雌M.chitwoodiの一部を包み込んでいます(C)。バール = 500 μm (A)、100 μm (B、C)、20 μm (D)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7: Meloidogyne chitwoodiによって形成されたトランスジェニック根こぶの細胞構造 (A)過ヨウ素酸シッフ(PAS)とトルイジンブルーOで染色されたトランスジェニック根こぶの極薄切片で、成虫のメスの摂食部位と(B)根こぶ組織に包まれた線虫によって誘導された巨大細胞を示しています。バー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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