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方法論記事

生細胞におけるGタンパク質共役受容体活性を測定するためのBRITベースのGタンパク質バイオセンサー

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DOI：

10.3791/68463

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2025年11月7日

 ,  ,  ,  , 
1CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

この記事について

訂正のお知らせ

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サマリー

このプロトコルは、Gタンパク質共役型受容体リガンド刺激による生HEK293細胞におけるGタンパク質活性化のリアルタイム測定のためのBRITベースのバイオセンサーの使用について説明しています。ここでは、β2-アドレナリン受容体とカンナビノイド1型受容体を例として、いくつかのGタンパク質サブタイプおよびさまざまなGPCRにわたるセンサーの効率を実証します。

要約

G タンパク質共役受容体 (GPCR) は膜貫通受容体の最大のファミリーを構成し、細胞外刺激を細胞内応答に形質導入することにより、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たします。GPCRの活性化は、ヘテロ三量体Gタンパク質との相互作用を可能にするコンフォメーション変化を引き起こします。活性化すると、Gα サブユニットは GDP-GTP 交換を受け、Gβγ 二量体から解離し、下流のシグナル伝達カスケードを引き起こします。GPCR を介した G タンパク質の活性化を研究するには、生物発光共鳴エネルギー伝達 (BRET) ベースのバイオセンサーが高感度で非侵襲的なアプローチです。Schihadaらによって開発されたGタンパク質ベースのトリシストロン活性センサー(G-CASEバイオセンサー)は、活性化の代用としてヘテロ三量体の解離を検出し、単一のプラスミドトランスフェクションを使用してGPCR活性のリアルタイムモニタリングを可能にし、共トランスフェクションアプローチの限界を克服します。BRET アッセイには、バックグラウンド ノイズの低減、光退色の低減、感度の向上など、蛍光ベースの技術に比べていくつかの利点があります。 このプロトコルでは、BRET ベースの G-CASE バイオセンサーを生細胞および 96 ウェルプレートで使用しました。具体的には、β2-アドレナリン受容体(β2-AR)とカンナビノイド1型受容体(CB1R)の活性をGタンパク質活性化の観点から評価します。β2-ARを一過性にトランスフェクトしたHEK 293T野生型細胞と、CB1Rを安定的に発現するHEK293T細胞を用いて、Gs およびGi3 G-CASEバイオセンサーの堅牢性を確認しました。このプロトコルは、薬理学的研究およびハイスループットGPCRスクリーニングにおけるこのアプローチの有用性をサポートし、例えば、バイアスされたシグナル伝達 を介して 特定の経路を活性化するリガンドの能力をよりよく理解し、したがって、新しい治療化合物の発見を促進します。

概要

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、膜貫通型受容体の最大のスーパーファミリーを表し、細胞外刺激を細胞内シグナル伝達カスケードに形質導入し、特定の生物学的応答をもたらす役割を果たします。これらは極めて重要な薬理学的標的であり、市販薬の約 30% が GPCR1 に作用します。GPCRリガンド結合は、受容体のコンフォメーション変化を誘導し、ヘテロ三量体Gタンパク質および/またはGPCRキナーゼ(GRK)およびβアレスチンとの相互作用を促進し、それによって下流のシグナル伝達または受容体の内在化を開始します2。

ヘテロ三量体Gタンパク質は、GPCRシグナル伝達の主要な細胞内トランスデューサーとして機能し、Gα、Gβ、およびGγの3つのサブユニットで構成されています。これらのヘテロ三量体は、Gαサブタイプに基づいてGi/o、Gs、Gq、G12/13の4つのファミリーに分類され、それぞれが異なるシグナル伝達経路を活性化します:Gi / oサブタイプはアデニル酸シクラーゼを阻害し、Gsはそれを刺激し、GqはホスホリパーゼC-βを活性化し、G12/13はRhoファミリーGTPaseを調節します。

GPCRの活性化はそれらのコンフォメーション再構成につながり、サブ秒の速度論内での迅速なGタンパク質の関与を可能にします。このプロセスにより、G タンパク質のコンフォメーション変化が誘導され、Gα サブユニットにおける GDP-GTP 交換が促進されます。GTP結合は、Gαサブユニットのコンフォメーションをさらに変化させ、その結果、Gβγ二量体から解離し、シグナルの伝播を可能にします。したがって、Gタンパク質は、アデニル酸シクラーゼやイオンチャネルなどの多様なエフェクタータンパク質を調節することにより、細胞応答の特異性と時間的ダイナミクスを調節する上で重要です3,4,5。

このプロトコルは、生細胞におけるGPCRリガンド刺激時に、生物発光共鳴エネルギー伝達(BRET)ベースのバイオセンサーを使用したGタンパク質の活性化または不活性化の測定の概要を示しています。 Gタンパク質バイオセンサー6,7,8,9の先駆的な研究に触発されたG-CASE(Gタンパク質トリシストロン活性センサー)システムは、Schihadaらによって導入され、標識されたG αとGβγサブユニット間のBRETに基づいており、単一のプラスミドトランスフェクションのみを必要とする合理化されたアプローチを提供します。この特徴により、ヘテロ三量体Gタンパク質の3つのサブユニット(Gα、Gβ、およびGγ)をコードする複数のプラスミドの共トランスフェクションに関連する感度が向上し、課題が軽減されます。これらのセンサーは、学術研究グループに商業的に提供されています( 材料表を参照)。

BRET には、Förster Resonance Energy Transfer (FRET) に比べて大きな利点があります。BRITでは、外部光源を必要とせずに、生物発光ドナーと蛍光アクセプターの間でエネルギー伝達が行われます。この固有の生物発光により、自家蛍光や光散乱などのFRETに関連する問題が軽減され、その結果、バックグラウンドシグナルが低くなり、アッセイ感度が向上します6,7,11。

BRET には外部励起がないため、光退色と光毒性の影響が最小限に抑えられ、FRET と比較してバックグラウンド信号が低くなります。その結果、BRETアッセイはほとんどの場合、感度が向上し、構成活性GPCRのGタンパク質活性化の測定が可能になります。BRET アッセイの感度の向上により、微妙な生物学的相互作用の検出が容易になり、これは受容体活性の正確な測定が重要な薬理学的研究において特に価値があります。

これらのバイオセンサーは、Scott-Dennisらによって最近実証されたように、96ウェルまたは384ウェルプレートでのハイスループットスクリーニングに変換することができ、カンナビノイド受容体CB1RおよびCB2Rの活性を分析するために、これらのバイオセンサーを使用する方法がメンブレンベースの384ウェルアッセイで開発されました12。本稿では、Gs タンパク質とクラスAGPCRに属するCB1Rに結合し、Gi/o ファミリータンパク質を活性化するクラスAプロトタイプGPCRとしてのβ2-ARの活性を測定することにより、生細胞の96ウェルプレートにおけるこれらのバイオセンサーの使用について説明します。2つのG-CASEバイオセンサーの使用が検証されています:HEK 293T細胞におけるG-s およびGi3 は、GPCRが一過性(β2-ARを使用)または安定的に発現(CB1Rを使用)します。

この実験はさまざまな細胞株で実行でき、さまざまな細胞環境にわたるこの技術の多用途性と堅牢性を実証することに注意することが重要です。これにより、この方法をさまざまな実験モデルに適用できることが保証され、さまざまな生理学的および薬理学的設定で GPCR シグナル伝達を研究するための貴重なツールになります。 図1 は、BRITベースのGタンパク質活性センサーの原理を示しています。

figure-introduction-1
図1:BRITベースのGタンパク質活性センサーの原理。 Gタンパク質センサーは、Gα、ネイティブGβ、Gγの3つのサブユニットで構成されています。Gα サブユニットは小さくて明るいナノルシフェラーゼ(Nluc)に融合し、Gγ サブユニットは円形に並べ替えた金星(cpVenus173)でN末端標識されています。これらの操作されたGタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、単一のプラスミドに結合されます。GPCRへのリガンド結合は、GPCRのコンフォメーション変化を誘導し、Gタンパク質の動員とそれに続く解離を促進し、それに続くGTP加水分解を促進します。この解離によりパートナー間のエネルギー伝達が妨げられ、その結果、BRET 信号が減少します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. ウェルプレート播種(1日目)

注:無菌状態を維持するために、滅菌層流フード内のすべての細胞培養プロトコルに従ってください。透明な平底を持つ白いウェルプレートは、細胞の成長と生存率を追跡するために使用されます。手順3.2.1のステッカーの使用を避けるために、フルホワイトウェルプレートを使用してください。

  1. ウェルプレートコーティング
    注:このステップをバイパスするために、プレコートプレートを使用できます。
    1. 約6 mLの滅菌ろ過ポリ-L-リジン(PLL)溶液(0.01%)をマルチチャネルリザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、96ホワイトウェルマイクロプレートの各ウェルに60 μLのPLLを充填します。
    2. マイクロプレートを暗い場所に置き、20分間インキュベートします。
    3. インキュベーション中、ステップ1.2.1〜1.2.3で説明されているように細胞の調製を進めます。
    4. マルチチャンネルピペットでPLL溶液を吸引し、15 mLチューブに4°Cで保存します。
    5. プレートをDPBSで3回洗浄して、細胞の劣化を引き起こす可能性のある遊離PLLを除去します。
  2. 細胞調製とプレーティング
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを37°Cで5%CO2で添加したDulbeccoの修飾Eagle培地でHEK293細胞を培養します。
      注:FBSは、適切な細胞生存率に必要な栄養素と成長因子を提供するために培地に添加されます。
    2. 培地を取り出し、2 mLのDPBSで細胞をすすぎます。
    3. 0.5 mLのトリプシンを加え、細胞を剥離するために37°Cで3〜5分間インキュベートします。
    4. フラスコに4.5 mLのDMEMを加えてトリプシンを中和し、ピペットを上下に繰り返しして細胞を剥離し、再懸濁します。
    5. 剥離した細胞を15 mLチューブに移し、1000 x g(室温、RT)で5分間遠心分離します。
    6. 上清を取り除き、ペレットを2 mLのDMEMに再懸濁します。
    7. マラセス計数チャンバーで細胞をカウントし、300,000細胞/mLで9mLを調製します。それらをマルチチャンネルリザーバーに入れ、マルチチャンネルピペットでウェルあたり100 μLを注いで96ウェルマイクロプレートを播種します(最終密度は30,000細胞/ウェル)。
    8. マイクロプレートを37°C、5%CO2 で約24時間インキュベートします。
      注:効率的なトランスフェクションのために、細胞は約70%〜80%のコンフルエンスに達する必要があります。

2. プラスミドトランスフェクション(2日目)

注:細胞トランスフェクションは、プレーティング前の1日目、ステップ1.2.7中に懸濁細胞に対して、および3日目にデータ取得に実行できます。

  1. 所望のプラスミドDNA(例えば、HEK wt細胞では5μgのβ2-アドレナリン受容体および5μgのGs(short)-CASE、HEK CB1細胞では10μgのGi3-CASEのみ)および20 μLのリポフェクタミンを500 μLのOpti-MEM培地を含むチューブに希釈します。RTで5分間インキュベートします。
    1. ネガティブコントロールの場合、β2-アドレナリン受容体を同じ濃度の空のプラスミドpcDNA 3.1に置き換えます。溶液を1本のチューブに混ぜ合わせ、混合してトランスフェクション混合物(1 mL)を得る。
  2. トランスフェクション混合物をRTで20分間インキュベートします。
  3. ステップ2.2のトランスフェクション混合物10 μLを各ウェルに滴下し、プレートを前後にゆっくりと揺らして完全に混合します。
    注:ウェルあたり100 ngのDNAの最終濃度が得られます。
  4. マイクロプレートを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。

3. データ取得(3日目)

  1. リガンドの調製
    注:ハンク平衡塩溶液(HBSS)バッファー:NaCl 140 mM、塩化カリウム5 mM、塩化カルシウム1 mM、硫酸マグネシウム七水和物0.4 mM、塩化マグネシウム六水和物0.5 mM、リン酸ナトリウム二塩基性二水和物0.3 mM、リン酸カリウム一塩基性0.4 mM、D-グルコース(ブドウ糖)6 mM、重炭酸ナトリウム4 mM、pH 7.4、ろ過0.22 μm。
    1. 異なるリガンドに適した可溶化溶媒で可能な限り最高濃度のストック溶液を調製します(このプロトコルでは、イソプロテレノールはH20 mQで調製され、WIN-55.212-2はDMSO中で調製されます)。
      注:リガンド原液の濃度は、リガンドの溶解度と既知の解離定数(Kd)に応じて調整する必要があります。
    2. このストックから、適切な可溶化溶媒中でリガンドのKd 付近の範囲のリガンド連続希釈液を10 μL調製します。この連続希釈液を-20°Cで保存します。
      注:リガンドによっては、分解が発生する前に、連続希釈範囲を最大10回凍結および解凍できます。ビヒクル条件(このプロトコルでは、H20またはDMSO)を含むリガンド溶解に使用される溶媒のみを含む溶液を調製します。
    3. リガンド濃度とビヒクルごとに、各濃度の1.3 μLを総体積130 μLに添加することにより、HBSSで1/100希釈します。これにより、HBSS 中の最終濃度は 1% のビヒクルになります。
      注:この最終希釈範囲は、ウェルあたり100 μLの総容量を得るために10 μLを添加することによる実験に使用される範囲です。これにより、すべてのウェルの最終濃度は 0.1% のビヒクルになります。130 μLの容量は、96ウェルプレートの1列を充填するのに必要な量((10 x 12)±10%に相当します。各行は異なるリガンド濃度に対応し、最後の行がビヒクルコントロールとして機能します。
    4. ストック溶液から980 μLのフリマジン1/100希釈液を調製します(970.2 μLのHBSSに9.8 μLを投与して、総容量980 μLを得る)。
      注:フリマジンの新鮮な溶液を調製し、少なくとも3分間インキュベートします。その後、取得直前に追加します。信号の半減期は室温で約120分であるため、早すぎる準備はしないでください。この制限を克服するために、ビバジンやエンデュラジンなどの長時間作用型フリマジン誘導体を使用できます。これらの基板は、最大48時間安定したBRET信号を維持します。
  2. プレートの読み取り値
    メモ: マルチモードプレートリーダーを使用してください。研究した条件と反復回数に合わせて測定を調整します。ここで、データ取得は、32ウェルに対応する4列の3つの読み取り値に分割されます。すべての測定値は、バッファーの蒸発を防ぐために透明な蓋が付いた上部光学系で行われます。すべての測定値の前に、測定ゲインを調整します。この研究では、ゲインは3600に固定されました。多くのプレートリーダーで利用可能な自動インジェクターまたはシリンジシステムを使用することで、手動のリガンド添加を回避できます。
    1. 96ウェルプレートの最初の4列から培地を取り除きます。各ウェルを100 μLのHBSSですすぎ、80 μLのHBSSを加えます。プレートの裏側に白いシールを貼ります。これにより、蛍光および/または生物発光の測定が向上します。
    2. Gタンパク質発光スペクトルの記録:96ウェルプレートをプレートリーダーに挿入します。535/30 nmモノクロメーターを使用してcpVenus173 の発光を記録し、500〜600 nmの発光を2 nmの分解能で測定します。
      注:この記録は、cpVenus173 励起時に蛍光が放出されることを保証するためのコントロールです。
    3. Gタンパク質発光スペクトルの記録:450/40nmモノクロメーターを使用してNluc発光強度を記録し、400nmから600nmの間の発光発光を5nmの分解能で測定します。
      注:この記録は、Nluc基質であるフリマジンを添加する前に生物発光が放出されないようにするためのコントロールです。
    4. プレートリーダーからプレートを取り外し、マルチチャンネルピペットを使用して、事前に調製したフリマジン溶液(ステップ3.1.4)10 μLを各ウェルに加えます。
    5. 手順 3.2.3 を繰り返します。
      注:この記録は、フリマジンの添加時に生物発光が放出されることを保証するためのコントロールです。この測定後、直接ステップ3.2.6に進み、フリマジンの消費や劣化による信号の変動を防ぎます。BRET シグナルの変動は、フリマジンの消費および/または分解、およびアゴニスト刺激によって誘発される応答を終了させる調節プロセスによって発生する可能性があります。この制限を克服するために、GRK阻害剤(CMPD101)および内在化阻害剤(ダイナソール)、またはGRKまたはアレスチンを欠く遺伝子編集細胞を使用することができます。
    6. Gタンパク質基礎BRITの記録:GPCRリガンドを添加する前に、それぞれ450/40 nmおよび535/30 nmモノクロメーターを使用して、NlucおよびcpVenus173 の発光強度を記録します。測定間隔時間0.30秒(合計読み取り時間3分)で60秒のサイクルを3回測定します。
      メモ:測定間隔時間を0.90秒に長くすると、通常、信号対雑音比は大幅に向上しますが、読み取り時間が大幅に長くなります。実験者は、より高い時間分解能と改善されたS/N比のどちらがアプリケーションにとってより重要かを決定する必要があります。
    7. プレートリーダーからプレートを取り外し、マルチチャンネルピペットを使用して、1つのカラムの各ウェルにそれぞれ10 μLのGPCRリガンドの事前に調製した希釈範囲(ステップ3.1)を追加します。他の 3 つの列についても同じ手順に従います。
    8. Gタンパク質リガンド誘導BRATの記録:それぞれ450/40 nmおよび535/30 nmモノクロメーターを使用して、NlucおよびcpVenus173 の発光強度を記録します。測定間隔時間0.30秒(合計読み取り時間16分)で60秒のサイクルを16回測定します。
      注:カラム内のウェルを測定するための測定パラメータを設定します。重複は 2.4 秒の時間差で読み取られます。
    9. 手順 3.2 を繰り返します。次の4列を2回。

4. データ分析

メモ:各読み取りのデータを個別のデータスプレッドシートファイルに収集します。

  1. 測定値を制御する
    1. 波長に対する発光強度をプロットします。
  2. 基礎 BRET 測定値
    1. ウェルごとに、3つのリードのBRET比を計算します。BRET 比率は、アクセプター放出/ドナー放出として定義されます。
      figure-protocol-1
    2. 各ウェルについて、リガンド添加前の3つのBRET比の平均を計算します。この値は、リガンド刺激前の基礎BRET比と呼ばれます:基礎比。
    3. すべてのウェルの以前のBRET比を正規化するには、3つの測定のそれぞれについて、対応する測定時のBRET比から車両制御ウェルから計算されたBRET比値をそれぞれ差し引きます。
      注:分析されたデータは、リガンド添加前の時点に対応しています。リガンドが添加されている井戸が既知であるため、それに応じてビークル制御井戸を識別できます。
  3. Gタンパク質リガンド誘導BRET測定値
    1. 各ウェルについて、セクション4.2.1で説明されているように、各リードのBRET比を計算します。これらの値は、Ratiostim と呼ばれます。
    2. リガンドによる変化を定量化するには、各ウェルの各レシオスティム のΔBRET を基礎に対するパーセントとして計算します。そのためには、セクション4.2.2で以前に 計算された対応するRatio基本を使用します。
      figure-protocol-2
    3. ΔBRET(%)を計算して、各ウェルのΔBRET値を正規化します。そのためには、車両のそれぞれのΔBRET値を差し引きます。
    4. データスプレッドシートでΔBRETの速度論を視覚化するには、ステップ4.2.3で正規化された3つの基本BRET測定値を追加します。セクション4.3.3の各ウェルについて計算された対応するΔBRET(%)値の前にあります。
    5. 読み取りの時間に対して前のデータをプロットして、キネティックグラフを取得します。
    6. プラトーに達したら、選択した時間にΔBRET(%)値を取得し、各ウェルが異なるリガンド濃度に対応するため、使用するリガンドの濃度に対してプロットします。用量反応曲線が得られます。
      注:プラトーは通常、リガンド刺激の約5分後に到達します。このプロトコルでは、15分間のリガンド刺激後に得られた値がプロットされます。異なる実験のデータを比較するには、活性化の速度に応じて時間を調整します。
    7. 解析ソフトウェアで以前のデータをプロットし、次の式に基づいてシグモイド線量応答 3 パラメーター近似を使用して近似します。
      figure-protocol-3
      ここで、Xは使用されたリガンドの濃度、YはΔBRET(%)値、上と下はプラトーを表し、EC50 は最大効果の50%に達するために必要なリガンド濃度です。これにより、Emax と EC50 を得ることができます。
    8. ノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用して、対照条件のデータを比較します。結果は p < 0.05 で有意であると見なされます。

figure-protocol-4
図2:BRETアッセイを実行するための主要なステップ。このプロトコルで概説されている3つの主要な実験ステップ(細胞播種、細胞トランスフェクション、およびBRETシグナル取得)の概要と、データ取得のための詳細なステップワイズガイド。実験セットアップ:1日目に、細胞は、30,000細胞/ウェルの密度で平らで透明な底を持つPLLプレコートされた白色の96ウェルプレートに播種されます。2日目に、選択したGタンパク質センサーを、研究したGPCRまたはpcDNA3.1プラスミドのいずれかとともに細胞にトランスフェクトします。24時間のインキュベーション後、リガンド添加時の生物発光および蛍光測定値によってGタンパク質センサー活性を測定します。データ収集:細胞のHBSS洗浄後、80 μLのHBSSをウェルに添加し、535/30 nmモノクロメーターを使用して500 nmから600 nmの間でcpVenus173蛍光発光を測定します(1)。次に、Nluc生物発光は、フリマジンの添加前(2)と(3)の両後に、450/40nmモノクロメーターを使用して400 nmから600 nmの間で測定されます。最後に、基礎およびリガンド誘発性Gタンパク質活性のBRETシグナルは、それぞれ450/40nmおよび535/30nmモノクロメーターを使用して、3分(測定間隔0.30秒で60秒の3サイクル)(4)および16分(測定間隔0.30秒で60秒の16サイクル)にわたって測定されます(5)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

実験のセットアップと実行の一般化されたスキームを 図2に詳細に示します。2つのGPCRのリガンド活性化後のG-s またはGi/o ファミリータンパク質の活性化は、G-CASEバイオセンサーを使用して評価されました。まず、プロトタイプファミリーA GPCRを研究し、β2-ARをHEK 293T細胞に一過性にトランスフェクトしました。アゴニスト(すなわち、イソプロテレノール)をGs(short)-CASEタンパク質センサーとともにβ2-ARを発現するHEK wt細胞に適用すると、BRETシグナルの濃度依存性の減少が観察され、Gs タンパク質の活性化が示されました(図3B)。ΔBRET 値は、飽和に達するまでリガンド濃度に応じて減少し、リガンド刺激の約 5 分後にプラトーが観察されました。対照的に、空のpcDNA3.1プラスミドとGs(short)-...

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ディスカッション

本プロトコルは、特定のリガンドによるGPCR刺激に応答して生細胞におけるGタンパク質活性化をリアルタイムで測定するためのBRETバイオセンサーの使用について説明しています。このアプローチは、生物発光ドナー-アクセプターエネルギー伝達原理を使用することにより、受容体活性化時のヘテロ三量体 G タンパク質のコンフォメーション変化と解離の検出を可能にし、GPCR シグナル伝達を研究するための堅牢で高感度のプラットフォームを提供します。このプロトコルは、クラスBおよびクラスC GPCRおよび孤立GPCRを含むさまざまなGPCRファミリーに適応および適用できます10,12。例として、クラスA GPCR、β2−AR、およびCB1Rによる結果が本明細書に報告される。

対応するアゴニストによるGPCR刺激は、Gタンパク質の動員を誘導し、最終的に2つのサブユニットに解離します:片側のGα と他方...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

HEK-CB1細胞はM. Guzman(コンプルテンセ大学、マドリッド、スペイン)からの親切な贈り物であり、β2-アドレナリン受容体プラスミドはD. Perrais(IINS、学際的な神経科学研究所、ボルドー、フランス)からの親切な贈り物でした。Gi3-CASEおよびGs(short)-CASEは、Gunnar Schulte(Addgeneプラスミド#168122;Addgeneプラスミド#168124)。イラストの一部は BioRender.com を使用して作成されています。この研究は、フランスの Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche と、フランス国立研究機関 (ANR) PolyFADO (ANR-21-CE44-0019)、AlzCaBan (ANR-24-CE44-4647)、および SCHIZOLIP (ANR-22-CE44-0034) からの資金提供によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
高度な96ウェル培養プレート、白色で透明な平底、蓋付き、Greiner bio-oneですドゥッチャー655983
BrightMax クリアライン ホワイトフィルムドゥッチャー760245
クラリオスターLVFBMGラボテック
ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマD4540
DPBSは塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まない液体で、無菌ろ過済みで、細胞に適合していますシグマ D8537
ダルベッコ改良型イーグル」s中(DMEM)グルタMAXシグマD082237度で温かい;使用前のC水浴
胎児用牛血清(FBS)シグマ F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-Venusアッドジーネ168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
グンナー・シュルテからの贈り物
Galphas(ショートアイソフォーム)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-金星アッドジーネ168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
グンナー・シュルテからの贈り物
HEK-293Tが安定的にCB1Rを発現(HEK CB1)M. グスマン(コンプルテンセ大学、マドリード、スペイン)からのご厚意
HEK-293T 野生型(HEK重量)
イソプロテレノールシグマI6504H20に溶け込み、&ndashに保存;20 & deg;C
リポフェクタミン 2000インビトロジェン 11668019
Opti-MEM I 低減血清中GlutaMAXサプリメントフィッシャー11564506
pcDNA3 フラグ β-2-アドレナリン作動受容体タグ FLAG C-terD. ペレ(IINS、ボルドー)よりご厚意で寄贈されました
pcDNA3.1-(空)-TAGアッドジーネ138209
ペニシリン/ストレプトマイシンシグマ P4333
ポリL-リジン溶液(PLL)シグマRNBL7086
トリプシン-EDTA シグマ T3924
勝利:55,212-2ケイマン・ケミカルズ10009023DMSOに溶合され、&ndashに保管されています。20 & deg;C

参考文献

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Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

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GPCR BRET G 96 HEK293T 2 CB1
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