標準化されたブタからマカクへの異所性心臓異種移植モデル

心臓異種移植は、移植が必要であるが、ドナー不足により適切なドナー臓器を受け取ることができない末期心不全患者に新たな希望をもたらします。前臨床評価研究では、生命維持心臓異種移植は最大9か月の生存期間を達成しており、ヒト臨床試験の開始に必要な有効性基準を満たしています¹。これらの知見に基づいて、米国食品医薬品局(FDA)は、遺伝子編集ドナー心臓を使用した心臓異種移植の2つの臨床例に対するアクセス利用の拡大を承認した。これらの臨床例は心臓異種移植の実現可能性を実証していますが、異常な心肥大や抗体媒介性拒絶反応など、いくつかの未解決の課題が浮上しています 2,3,4,5。したがって、追加のデータを提供し、将来のヒト臨床試験の安全性を確保するための新しい免疫抑制レジメンを開発するには、適切な実験室での実践条件下での大型動物モデルでのさらなる前臨床研究が必要です。

同所性心臓異種移植片の長期生存は、拒絶反応だけでなく、原発性移植片機能障害によっても制限されます。原発性機能障害の全体的な発生率は、さまざまな研究チームで約 40% から 60% の範囲であると報告されています ^4,6,7。ブタドナーの心臓の虚血性損傷に対する感受性が高まっているため、一部のグループは、一次移植片機能障害の発生率を減らすために低体温灌流装置を開発しました。しかし、術後の心肥大を制御することは依然として困難です。成長ホルモン受容体(GHR)ノックアウトドナーブタであっても、GHRの欠如により心機能が損なわれる可能性があり、それによって移植片の長期生存率が制限される可能性があります^2,3。これに関連して、異所性心臓異種移植にはいくつかの利点があります:過度の前負荷と後負荷を回避し、外科的処置を簡素化し、総虚^{血時間を短縮}します^8,9。このモデルは、異種拒絶反応によって引き起こされる移植片損傷をよりよく反映しており、同所性移植とは異なり、異所性心臓異種移植は、移植片の長期生存、in vivo生検のための開腹術の繰り返し、および免疫活性化と動的免疫細胞機能の長期観察を可能にします。これは、異種免疫拒絶メカニズムを調査し、新しい免疫抑制戦略の有効性と安全性を評価するための貴重なモデルとして機能します^10,11。

しかし、ほとんどの腹部異所性心臓異種移植モデルではヒヒがレシピエントとして利用されていますが、実験動物としてのヒヒの調達は多くの国で依然として困難です。対照的に、マカクは最も広く使用されている非ヒト霊長類であり、ヒトとの系統発生的相同性が高いため¹²、異種移植研究の実用的な代替手段となっています。それにもかかわらず、ヒヒに比べて体のサイズが大幅に小さいため、ヒヒの独特の解剖学的寸法に対応するために、特定の手術プロトコルの適応が必要です。

この研究は、GTKO ブタからマカクへの異所性心臓異種移植のための段階的なプロトコルを提示します。α-Galノックアウトピッグ(GTKO)の使用は、主に心臓異種移植後数分以内に移植片の失敗につながる超急性拒絶反応を防ぐことを目的としています。それは次のように構成されています:(1)ドナーブタとレシピエントマカクの間のマッチング原則。(2) 異所性心臓異種移植のための外科的処置の最適化。(3) 周術期管理。この研究は、これらの移植技術を普及させて研究チーム間の比較可能性を促進し、心臓異種移植研究の再現性と翻訳的関連性を高めることを目的としています。

この研究は、不外病院の動物倫理委員会によって承認されました (FWAEC-JL-010-1/0-2020)。腹部圧迫を最小限に抑えるために、体重>9kg、10〜15歳のオスのマカク、および体重5〜6kg(~60日齢)のオスのバマミニブタを使用しました。ドナーの心臓による腹部圧迫を防ぎ、移植後の成長に対応するために、より大きな体のマカクが優先されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. ドナーとレシピエントの選定基準

1. 受信者マカクの選択
   1. 既存の抗体スクリーニング: フローサイトメトリーを使用して、事前に形成された異種抗体のレベルを評価し、免疫学的リスクの低いレシピエントの選択を可能にします。
      注:このアッセイでは、GTKOブタ大動脈由来のGTKOブタ内皮細胞は、前述のように酵素消化によって単離されます¹³。
      1. GTKOブタ内皮細胞をレシピエント血漿でインキュベートします。
      2. マカクIgMおよびIgGに対する蛍光標識二次抗体を用いて、ブタ細胞へのマカクIgMおよびIgGの結合を定量化します。予備形成された抗体レベルが低いレシピエントを選択します。
   2. ベースラインの健康評価: 血清生化学、全血球計算、および凝固機能検査を実施して、適切なベースライン臓器機能を確認します。
2. ドナーブタの選択基準
   1. 心エコースクリーニング:左心室および右心室機能が正常で、心臓弁の構造的または機能的異常がなく、駆出率が65%を超え、肺高血圧症の証拠がないドナーブタを選択します。
   2. 性別のマッチング:レシピエントと同性のドナーブタを選択します。
   3. 血液型:血液型O型のドナーブタを選択します。

2.術前の準備

1. 麻酔と鎮静
   1. 麻酔:ケタミン(10 mg / kg)とミダゾラム(1 mg / kg)でマカクを誘導します(施設が承認したプロトコルに従って)。導入後、イソフルラン (2%-3%) とデクスメデトミジン (1 μg/kg/h) およびプロポフォール (1-2 mg/kg/h) で麻酔を維持します。
   2. 挿管:5.0mm気管内チューブでドナーブタを挿管します。5.5 mm気管内チューブでレシピエントマカクを挿管します。
   3. 尿管カテーテル挿入: 6-F ダブルルーメン尿道カテーテルをマカクに挿入します。ドナーブタでは省略します。
2. 手術野の準備と消毒
   1. 皮膚の準備: 胸、首、腹部、背中、手足から毛を切り取ります。
   2. 消毒: ひづめ(豚)や手足(サル)など、剃った部分をポビドンヨードでこすります。
3. レシピエントの中心静脈カテーテル留置
   1. ポジショニング: 右頸部領域の露出を最適化するために、肩を上げた部分的な左側臥位にレシピエント マカクを配置します。中心静脈アクセスの優先部位として適切な内頸静脈を選択します。
   2. 滅菌とドレープ: 標準的な無菌手順に従って、手術野を消毒し、ポビドンヨードでドレープします。
   3. 切開と血管の露出:胸鎖乳突筋の内側約1cm、内側の境界に平行に5cmの切開を行います。筋膜の鈍的解剖を行い、筋肉を横方向に引っ込めます。
      1. 頸動脈鞘の外側にある外頸静脈を特定します。内頸静脈の小さな連絡枝を慎重に結紮します。頸動脈鞘を開き、内頸静脈、迷走神経、頸動脈を露出させます。
   4. カテーテル挿入: 逆行性トンネリング技術を使用して、8-F トリプル ルーメン中心静脈カテーテルを挿入します。無菌条件下でカテーテルの近位端をトンネリング針に接続し、トンネルを通して首の切開部に引き込みます。
      1. 肩甲骨の中点で遠位端を外側にします。カテーテルの先端が上大静脈と右心房の接合部に確実に到達するように、カテーテルを適切な長さにトリミングします。
   5. 切開閉鎖:傷を層状に閉じます。3-0吸収性縫合糸を使用して筋膜と皮下組織を閉じ、1-0シルク縫合糸で皮膚を閉じます。感染リスクを最小限に抑えるために、筋膜層の下にカテーテルを完全にカバーし、確実に固定します。
      1. 中心静脈カテーテルは、マカクザルの術後の投薬および容量蘇生のための重要な輸液アクセス経路として使用します。カテーテルの完全性を維持し、感染を防ぐために、毎日ポビドンヨード消毒と滅菌ガーゼ包帯を実施します。
      2. 信頼性の高い血管アクセスを確保するために、最終犠牲処置まで中心静脈カテーテルをその場に維持します。

3. レシピエント手術(着床前段階)

1. 腹部正中線切開
   1. 切開の選択:長さ約12〜15 cmの正中線腹部切開を行います(図1A)。
   2. 切開の詳細:皮膚、表在筋膜、白線筋膜、横筋膜、腹膜下筋膜(腹膜外脂肪を含む)を順次切開し、頭頂腹膜を切開して腹腔にアクセスします。皮膚切開には#23手術用ブレードを使用し、より深い組織解剖には電気焼灼を使用して、切断と止血を同時に実現します。
2. 腹部探査と腸の管理
   1. 癒着溶解: 腸と腹壁の間の癒着の存在に焦点を当てて、腹腔を探索して癒着を評価します。癒着がある場合は、組織損傷を最小限に抑え、術後の機械的腸閉塞のリスクを減らすために、電気焼灼を使用して癒着を注意深く解剖します。
   2. 腸の保護:小腸をそっと外側に出し、腹部大動脈と下大静脈を露出させるために滅菌湿ったガーゼの上に置きます。
3. 腹部大動脈と下大静脈の露出
   1. 腹部大動脈と下大静脈を動員する: 腹部大動脈と下大静脈から周囲の組織を注意深く解剖し、血管損傷や出血のリスクを最小限に抑えます。腎動脈の起点と腸骨動脈の分岐点の間の腹部大動脈と下大静脈を可能な限り完全に露出させます。
   2. 血管枝の取り扱い:解剖中に下腸間膜動脈とそれに付随する静脈を保存します。すべての腰枝を細心の注意を払って保存します。

4. ドナー心臓の調達

1. 胸骨正中切開術と血管可動化
   1. 正中胸骨切開術:胸腔にアクセスするために正中線胸骨切開術を行います(図1B)。Lebsche胸骨ナイフを使用してドナー胸骨を慎重に分割します。
   2. 血管の動員:胸腔を露出させた後、心膜を切開し、注意深く解剖して上行大動脈と主肺動脈を分離します。
2. 血管クランプと心臓冷却
   1. 血管クランプ:大動脈基部に4-0巾着縫合糸を配置し、心停止用の使い捨て順行性心停止カニューレを挿入します(図1C)。上大静脈と下大静脈を順次クランプし、続いて上行大動脈をクロスクランプします。
      1. 大動脈クロスクランプの直後に、肺静脈と下大静脈を切開して減圧し、切開が十分なドレナージに十分な大きさであることを確認します。
   2. 心臓冷却:心膜腔を吸引して残留血液を排出し、すぐに心臓を滅菌氷冷生理食塩水に浸して低体温環境(0〜4°C)を実現します。
3. 心停止および灌流モニタリング
   1. 心麻痺:圧力バッグを使用して灌流圧を150mmHgに維持します。ドナーの心臓に30 mL / kg体重のHTK溶液(たとえば、5 kgのブタの場合は150 mL)を灌流します。
   2. 灌流モニタリング: 大動脈基部と左心室を同時に触診して、適切な心停止送達圧を確認し、心室拡張を防ぎます。心停止注入が完了したら、触診と目視検査で心停止を確認します。心筋細動がないことを確認してから、ドナーの心臓切除を進めます。
4. 心臓切除と温存
   1. 心臓切除:心停止後、心膜腔に追加の氷を適用します(図1D)。心臓をそっと持ち上げ、外科用ハサミを使用して下大静脈と肺静脈を順次横断します。右上肺静脈を分割するときは、上大静脈と右心房の損傷を避けるために特に注意してください。
      1. 左心房の後壁を解離させながら気管を保護します。解剖が左心房蓋と肺動脈のレベルに達したら、心臓を一時的に心膜腔に戻します。
      2. 近位大動脈弓と上大静脈を解離して横断し、肺幹を露出させます。左心房屋根に向かって組織面に沿って解剖を続け、心臓とその大血管を切除できるようにします。
         注:出血を防ぐために、心臓切除後に奇静脈断端をしっかりと結紮します。
   2. 心臓温存:保存のために、移植された心臓をすぐに氷冷の生理食塩水に浸します。さらに、UW溶液は優れた心筋保護を提供するため、ドナーの心臓を30 mL/kgの容量で別のウィスコンシン大学(UW)溶液で灌流します(図1E)。
5. ヒトドナー心臓調達との主な違い
   1. 輸液圧設定: 圧力バッグ内の灌流圧を、心筋灌流に最適と考えられる 150 mmHg に設定します。
   2. 大動脈クロスクランプの位置:ブタは大動脈弓から左右の腕頭体幹の2つの主要な枝しか持っていないため、これらの枝の間にクロスクランプを配置します。ドナー大動脈の長さを長く保つために、クロスクランプの前にシルク縫合糸で右腕頭体幹を結紮します。
   3. 心室減圧戦略: 心室の過膨張を最小限に抑え、虚血時間を制限するために、定期的に左心室のみを減圧します。右心室が腫れ始めたら、奇静脈の上の上大静脈を開きます。左心室が腫れている場合は、右肺静脈を切開し、右肺門に向かって切り口を伸ばします。

5.ドナー心臓移植

1. ドナー心臓の準備
   1. ドナー心臓の準備: 4-0 プロレン縫合糸を使用して、ドナー上大静脈、下大静脈、および左心房の肺静脈開口部をしっかりと閉じます。
   2. 洞房結節の保存:ドナーの上大静脈と右心耳の近くにある洞房結節を保存します。
2. 肺動脈の下大静脈への端から側への吻合
   1. ヘパリン化:血栓形成を防ぐために、ドナーの心臓吻合の前にレシピエントマカクに5,000単位のヘパリンナトリウムを静脈内投与します。
   2. 肺動脈吻合:DeBakeyの非外傷性接線クランプをレシピエントの下大静脈に配置します。術後の狭窄を最小限に抑えるために、ドナーの肺動脈よりわずかに大きい縦切開を作成します。
      1. 両腕 5-0 プロレン縫合糸を使用して、レシピエント血管の内側 (管腔側) から外側に 1 本の針を挿入して、12 時の位置で吻合を開始します。ドナー肺動脈側からもう一方の針を挿入し、対応する12時の位置で内腔から外側に通します。
      2. 血管の外壁に最初の結び目を作ります。針の方向を逆にして、外側からドナー肺動脈の内腔に戻ります。神経フックを使用して縫合糸の張力を維持しながら、6時位置に向かって時計回りに連続縫合を続けます。
      3. 心臓を回転させて反対側を露出させ、もう一方の針に切り替え、12時から6時の位置に反対側の壁を、レシピエント血管では外側から内側、ドナー血管では内側から外側への針の挿入パターンで縫合し、エンドツーサイド吻合を完了します。
   3. 空気排出: 最後の結び目を固定する前に、吻合部位に生理食塩水を注入して、空気を完全に排出します。非外傷性血管クランプを使用してドナー肺動脈を閉塞し、下大静脈血管クランプを順次解放します(図1F)。
3. ドナー大動脈とレシピエント腹部大動脈へのエンドツーサイド吻合
   1. 大動脈吻合: DeBakey 非外傷性接線クランプを使用して、レシピエント腹部大動脈を部分的にクランプします。術後の狭窄を防ぐために、ドナー大動脈の直径よりわずかに大きい縦方向の切開を行います。
      1. 両腕 5-0 プロレン縫合糸を使用して、レシピエント大動脈の内側 (管腔側) から外側に向かって 12 時の位置に針を挿入することから吻合を開始します。ドナー大動脈からもう一方の針を12時の位置に挿入し、同じく内側から外側に挿入し、最初のステッチを血管外壁に結びます。
      2. 針の方向を逆にしてドナー血管を外側から内側に通し、神経フックで縫合糸の張力を維持しながら、時計回りに6時の位置まで連続して縫合します。心臓をひっくり返して反対側を露出させ、それに応じて針の方向を反転させ(ドナー血管では外側から内側、レシピエント血管では内側から外側に)、12時から6時まで連続して縫合し、端から側への吻合を完了します。
   2. 空気排出: 最後の結び目を結ぶ前に、吻合部に生理食塩水を注入して空気を除去します。腹部大動脈血管クランプを順次解放して循環を回復します(図1G)。
4. 再灌流と除細動
   1. 心室細動の予防:心室細動を防ぐために、再灌流の前に3 mg / kgのリドカインを静脈内投与します。ドナーの心臓を2分以内に自発的な収縮がないか観察します。
   2. 除細動: 心室細動が発生した場合は、パドルを両方の心室表面 (左右) に直接接触させて直接除細動を適用し、二相性 5 ジュール ショックを与えます。ドナー心臓の総虚血時間は約57.5分±6.1分でした(表1)。
5. ドレンの配置
   1. 陰圧ドレナージ:腹腔内に陰圧ドレナージチューブを配置して、術後の体液の蓄積を防ぎ、活動性出血を監視します。
   2. ドレーン除去の適応症:術後のドレナージ量を監視し、24時間の出力が25 mLを下回ったら腹部ドレーンを取り外します。
6. 腹部閉鎖
   1. 腹部閉鎖と超音波検査:腹壁を層状に閉じ、筋膜と皮下組織を3〜0本の吸収性縫合糸で近似し、1〜0本の絹縫合糸で皮膚を閉じます。術後の腹部超音波検査を実施して、心臓の活動を評価します(図1H)。

6. 術後管理と移植片モニタリング

1. モニタリングと一般的なケアのガイドライン
   1. 行動および症状のモニタリング: ビデオ監視を使用して、術後最初の 2 週間はレシピエントの状態を継続的に監視します。行動、食欲、腹部膨満、呼吸困難、浮腫、および正常な排便と排尿の毎日の評価を実行します。
      1. 体重、一般的な体調、外科的切開の治癒、中心静脈カテーテル感染の可能性、粘膜の外観、および腹腔内液の蓄積を監視します。
   2. 超音波評価: 超音波を使用して異所的に移植された心臓の機能を評価し、異常がある場合は周囲の滲出液を検出します。 図2 は、実験M3で観察された移植片の失敗とともに、術後1日目(POD)の拡張期および収縮期の異種移植片の心エコー画像を示しています。赤い線は、失敗した異種移植片における左心室壁の著しい肥大を示しています。

図1に示す手順に基づいて、再現性のあるブタからマカクへの異所性心臓異種移植モデルが確立されました。手術プロセスには、腹腔にアクセスするためのレシピエント マカクの正中開腹術と、心臓調達のためのドナー ブタの正中胸骨切開が含まれていました。心膜切開後、ドナーの心臓は HTK 溶液を使用して停止され、局所低体温下で UW 溶液でさらに保存されました。血管吻合は、ドナー肺動脈とレシピエント下大静脈の間、およびドナー大動脈とレシピエント腹部大動脈の間で端から左右に行われました。術後の心エコー検査評価により、ドナーの心臓が収縮期および拡張期機能を維持しながら収縮活動を再開したことが確認され、再灌流の成功と移植片の生存率が示されました。これらの結果は、モデルの技術的実現可能性と、ヒト以外の霊長類における異種移植片の長期機能モニタリングの可能性を示しています。

図1:ブタからマカクへの異所性心臓移植:外科的ステップと術後の超音波検査。 (A)マカクの腹腔は、層状解剖を伴う正中開腹術を通して入りました。(B) ブタドナーの胸腔にアクセスするために胸骨正中切開術が行われ、続いて心膜切開術が行われました。(C) 灌流カニューレをドナー心臓の大動脈基部に挿入した。(D)HTK溶液灌流によって誘発された心停止に続いて、ドナーの心臓を生理食塩水アイススラッシュで局所的に冷却しました。(E)その後、ウィスコンシン大学(UW)保存液による灌流が行われました。(F) ブタ肺動脈とレシピエントの下大静脈の間に端から側への吻合が作成されました。(G) ブタ大動脈とレシピエントの腹部大動脈の間に端から側への吻合が構築されました。(H) ドナー心臓の収縮期および拡張期機能を評価するために、術後の心エコー検査を実施しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: M3 の時系列心エコー画像。 (A) 術後日 (POD) の拡張期および収縮期の異種移植片の心エコー画像 1.(B) POD 3 での拡張期および収縮期の異種移植片の心エコー画像。(C) POD 10 での拡張期および収縮期の異種移植片の心エコー画像。(D) 移植片失敗時の拡張期および収縮期の異種移植片の心エコー画像。赤い線は、拡張期の左心室壁の厚さの有意な増加を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:ドナー心臓の総虚血時間。

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