ゼノファジーの複雑さを解明する: レジオネラ・ニューモフィラからの教訓

薬剤耐性菌株の蔓延により、感染症と戦うための新しい抗菌アプローチを模索することが不可欠になっています。オートファジーは、細胞が細胞タンパク質または細胞小器官を含む食細胞小胞を発達させる基本的な真核生物のプロセスであり、細胞の恒常性とさまざまな代謝プロセスの調節に不可欠な役割を果たします¹。オートファジーの知識が深まるにつれて、研究者らはオートファジー小胞が特定の細胞小器官、タンパク質、または病原体を選択的に標的にすることができることを発見^{しました2。}異食とは、細胞がオートファジーを通じて細胞内病原体を選択的に認識し、クリアランスのためにリソソームに送達するプロセスを指します³。このプロセスは、真核生物における自然免疫系の防御機構にとって重要です⁴。したがって、そのメカニズムと調節を解明することは重要な研究分野であり、新しい抗感染症戦略の開発に重要な意味を持ちます。

レジオネラ・ニューモフィラはグラム陰性細胞内病原体で、通常は水生単細胞原生生物に感染します。しかし、人間は汚染された水との接触から日和見感染症を発症し、重篤な肺炎であるレジオネラ症を引き起こす可能性があります⁵。レジオネラ菌は宿主細胞に入ると、IV 型分泌システム (T4SS) を使用して約 330 個のエフェクタータンパク質を輸送し、宿主免疫応答の回避を助け、細胞内での細菌の生存と増殖を確保します。レジオネラ菌は、サルモネラ菌と同様に、エフェクタータンパク質を使用して宿主の異食を妨げますが、正確な分子メカニズムはまだ確立されていません⁶。たとえば、チフス菌サルモネラ菌は、液胞V-ATPアーゼをADPリボシル化し、オートファジー開始をブロックするIII型分泌エフェクター(SopFなど)を送達します^7、一方、L.ニューモフィラはT4SSとRavZやSidEなどのエフェクターを使用して、異食の後期段階を妨害します^6,8。これらの異なる戦術にもかかわらず、両方の病原体は最終的に異食性クリアランスを回避し、オートファジー回避における収斂戦略を浮き彫りにしています。したがって、これらの病原性タンパク質の調査は、特定の抗感染症療法の開発に貢献するだけでなく、異食の分子的複雑さに光を当てる可能性も秘めています。

病原体の除去における異食のメカニズム

1984年、力久らは、リケッチアに感染した好中球がオートファゴソームを産生するという重要な発見を行い、細菌感染におけるオートファジーの関与の最初の例となり^{ました9。}さらなる研究により、ラパマイシンによるマクロファージのオートファジーの誘導により、オートファジー関連タンパク質 LC-3 および Beclin-1 が小胞を含む結 核菌 と共局在し、細胞内での細菌増殖が防止されることがわかりました¹⁰。さらに、 腸チフス菌、 リステリア菌、 フレックスネリ赤痢菌、 バークホルデリア・マレイ などの細胞内病原体がオートファジーを誘導し、その後宿主細胞内での増殖を制御することが知られています¹¹。

選択的オートファジーの一種である異食は、貨物認識、オートファジー受容体動員、およびリソソームを介した分解の3つの異なるプロセスで構成されます(図1に示す)。しかし、細胞が侵入した病原体を認識し(貨物認識)、オートファジーを開始するメカニズムは不明のままです。研究によると、細菌が細胞質に浸潤すると、ユビキチンリガーゼが病原体の表面に存在する病原体に感染した液胞またはタンパク質にユビキチンを付着させることが示唆されています12,13,14。次に、これらの標識タンパク質はユビキチンコートに集合し、病原体を包み込み、主にp62 / SQSTM1、NDP52、NBR1、およびオプチニューリンを含むオートファジーアダプターを動員するためのシグナル伝達プラットフォームとして機能します。オートファジーアダプターは、ユビキチン化タンパク質の結合を媒介するユビキチン結合ドメイン(UBD)とは別に、LC3相互作用ドメイン(LIR)を介してタンパク質と相互作用することにより、異食を促進します¹⁵。たとえば、LRSAM1やParkinなどの宿主E3リガーゼは、侵入する細菌にユビキチンを結合させ、それによって外食性クリアランスにフラグを立てるユビキチンコートシグナルを生成します^16,17。さらに、異食受容体は、細菌のファゴソーム表面のガレクチンに結合することによって、または細菌表面タンパク質と直接相互作用することによって、異食を開始することもできます^18,19。別の視点では、ファゴソーム内の細菌が膜を損傷することによって小胞のイオン勾配を変化させ、ファゴソーム膜上のV-ATPアーゼのコンフォメーション変化を引き起こし、ATG16L1^のWD40ドメインへの結合を通じてAtg5-Atg12-Atg16L1複合体を動員する可能性があると提案しています^7,20。ATG16L1は、WD40ドメインを介して飲み込まれた細菌をコーティングする補体C3に結合し、Atg5-Atg12-Atg16L1複合体を細菌ファゴソーム²¹に動員することもできます。これらの異なる認識メカニズムが異なる細菌種を標的としているのか、それとも感染の異なる段階で発生するのかは不明のままです。これらのメカニズムを完全に理解するには、さらなる研究と探索が必要です。

異食を回避するための病原体による戦略

宿主との共進化の過程で、細胞内病原体は異食を阻害するさまざまなメカニズムを発達させました22,23,24。これにより、感染中の食外反応が弱くなり、観察が困難になります²⁵.たとえば、ベータ溶血性連鎖球菌は、分解のためにp62、NDP52、およびNBR1を標的とするSpeBと呼ばれるシステインプロテアーゼを分泌します。SpeB欠失を有する変異体はオートファジーに抵抗できず、細胞内での増殖が抑制されました。これらの発見は、異食におけるこれらのオートファジーアダプターの重要な役割を裏付けています。赤痢菌フレックスネリの病原性タンパク質VirGは、Atg5を細菌表面に動員することにより異食を誘導することがわかっています¹⁹。しかし、この細菌は、ATG5 と VirG¹⁹ の結合を阻害するエフェクタータンパク質 IcsB を輸送するために III 型分泌システムも使用します。その結果、オートファジーの発生が防止されます¹⁹。細菌タンパク質とオートファジー機構の間のこの競合は、Atgタンパク質が細菌の表面タンパク質を直接認識して異食を開始できることを示唆しています。同様に、肺炎球菌の病原性タンパク質CpbCは、p62-CpbC-Atg14複合体を形成することによりAtg14のオートファジー分解を誘導し、それがAtg14のレベルを低下させます。これは、リソソーム相互作用を媒介するAtg14-STX17複合体に影響を及ぼし、それによって異食²⁶を阻害します。

サルモネラ菌をモデル細菌として利用した研究で、Xuらは、感染によって引き起こされる膜小胞の損傷がV-ATPaseによって検出され、ATG16L1⁷のWD40ドメインへの結合を通じて異食の活性化につながることを発見しました。この活性化は、典型的なオートファジー経路の一部ではありません。さらに、病原性タンパク質SopFは、V-ATPaseのADP-リボシル化(ADPRylation)を媒介し、異食を開始する能力^を阻害する能力を持っています7。これは、細菌とその分泌された病原性タンパク質が、通常の生理学的条件下では探索が困難なオートファジーの複雑な現象とメカニズムを調査および理解するための貴重なツールとしてどのように使用できるかを示しています。

レジオネラ菌 とゼノファジー

L. pneumophila は、宿主のユビキチン化²⁷、小胞輸送²⁸、エネルギー代謝²⁹、細胞運動性³⁰ などの重要な生物学的活性を操作することにより、レジオネラ菌含有液胞 (LCV) と呼ばれる複製ニッチを確立します。細胞内細菌内に多数のユビキチン化タンパク質が存在するにもかかわらず、³¹レジオネラ菌はオートファジーに対抗するさまざまなメカニズムを開発し、LCV とリソソームの融合を防ぎます ^6,8。

RavZはLC3-IIを切断することによりオートファジーを阻害します

オートファジーを調節することが判明した最初のレジオネラ菌エフェクタータンパク質は、RavZ(Lpg1683)です。システインプロテアーゼとして、RavZは炭素末端グリシンとLC3の以前のアミノ酸残基との間のアミド結合を切断し、LC3脂^質化の不可逆的な障害を引き起こします8。野生型レジオネラ菌と比較して、RavZ欠失(ΔravZ)を伴う変異株は、感染後に宿主細胞内のLC3-IIレベルとLC3点数の有意な増加を示しました⁸。遺伝子組み換えリステリア菌株(ΔhlyΔprfAcLLO)は、細胞に入ると強い食外反応を引き起こす可能性があります。細胞に同時感染すると、野生型レジオネラ菌はΔhlyΔprfAcLLO株の周囲にLC3の蓄積を抑制できますが、ΔravZは株による異食の誘導を阻害する能力を失^{います6。}さらに、宿主細胞におけるRavZの一過性発現は、飢餓誘発性オートファジー^を阻害します8。これらの結果は、RavZがオートファジーに拮抗するために広範なトランス作用効果(つまり、サイトゾルで拡散的に作用する)を発揮することを示唆しています。驚くべきことに、ΔravZ変異体の複製は宿主細胞では影響を受けず、ΔravZ変異体^を含むLCV膜上にLC3の明らかな動員は見られませんでした^6,8。これらの発見は、レジオネラ菌が宿主の異食を回避するために、RavZに加えて他のエフェクタータンパク質を利用する可能性があることを示唆しています。

SidEファミリーとゼノファジー

SidEファミリーは、SdeA、SdeB、SdeC、およびSidE³²という名前の、サイズが170 kDaを超える4つの相同タンパク質で構成されています。これらの病原性タンパク質は機能的冗長性で構造的に類似しており、そのすべてがモノADP-リボシルトランスフェラーゼ(mART)ドメインとホスホジエステラーゼ(PDE)ドメインを含んでいます。研究によると、ユビキチン活性化酵素(E1)およびユビキチン結合酵素(E2)が存在しない場合、SidEファミリーは独立したユビキチンリガーゼ(E3)として機能し、基質の特異的なホスホリボシルユビキチン化(PR-Ub)修飾を触媒することがわかっています^33,34,35。このプロセスは 2 つのステップで行われます。SdeAを例にとると、まず、SdeAは、そのmARTドメインを使用して、ユビキチン(Ub)のArg42残基をNAD+由来のアデノシン二リン酸リボース(ADPR)基で修飾し、ADPR-Ub^33,36の中間生成物を生成します。次に、ADPR-Ubのホスホジエステル結合はSdeAの機能的PDEドメインによって切断され、AMPが放出され、PR-Ubが基質タンパク質³⁶のセリン残基と結合します。

SidEファミリーには、多数の真核生物のタンパク質基質があります。Rab1A、Rab6A、Rab33BなどのGTPアーゼのホスホリボシルユビキチン化を媒介して小胞輸送を妨害することに加えて^33,37、最近の研究では、SidEファミリーが異食性6,38,39,40に対する拮抗機能も持っていることがわかっています。野生型レジオネラ菌と比較して、SidEファミリーコード遺伝子(ΔsidE)を欠く変異株は、LCV62でのp62の動員の有意な増加を示します6。トランスに作用するRavZとは異なり、SidEファミリーはシス(LCVで局所的に作用)で働き、レジオネラ菌自身の液胞を異食から保護します。SidEファミリー蛋白質を輸送するレジオネラ菌は、同時感染したΔhlyΔprfAcLLOリステリア株6の周りのp62の動員を抑制^{できません。}ΔravZ株と同様に、ΔsidE変異体も宿主の異食を回避できます。SidEが異食に拮抗するメカニズムは明らかではなく、ホスホリボシルユビキチン化によって媒介される宿主ユビキチン化システムへの干渉に関連している可能性があります。たとえば、SidEによるユビキチンのホスホリボシル化は、ユビキチン結合受容体によるLCVの認識を妨げ、それによってNDP52やオプチニューリンなどのアダプターの液胞への動員をブロックする可能性があります。

ゼノファジーに従事する他のエフェクター

RavZ と SidE に加えて、 L. ニューモフィラ は、オートファジー経路のさまざまな段階を標的とする他のエフェクター (LpSpl、Lpg1137、Lpg2936 など) をコードします。LpSplは、スフィンゴシン-1-リン酸リアーゼを模倣し、スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)を代謝産物に切断する分泌酵素です⁴¹。LpSplによるこのS1Pの枯渇は、スフィンゴシンの蓄積を防ぎ、mTORC1の活性化をもたらし、それによってオートファ^ジー41の開始を阻害します。Lpg1137は、オートファゴソーム-リソソーム融合に必要なSNAREタンパク質シンタキシン17(Stx17)を切断するプロテアーゼです⁴²。Stx17を分解することにより、Lpg1137はオートファゴソームの成熟を妨害し、異食⁴²の最終融合ステップをブロックします。Lpg2936は、オートファジー関連遺伝子( ATG7 や LC3Bなど)のエピジェネティックな修飾を引き起こし、発現を減少させる核エフェクターです⁴³。コアオートファジー成分のこのダウンレギュレーションは、転写レベル⁴³でオートファゴソームの生合成を阻害します。しかし、 レジオネラ菌 感染における LpSpl、Lpg1137、および Lpg2936 の役割についてはほとんど知られていません。 生体内での 異食回避へのそれらの寄与は、まだ完全には解明されていません。

表1は 、主要なL .ニューモフィラ の外食抑制に関与するエフェクター、それらの標的と機能、およびそれらが影響する外食の段階をまとめたものです。

今後の展望

主要な不確実性は依然として残っており、具体的な次のステップが示唆されています。まず、外食に作用するレジオネラ菌エフェクターの時間的階層は未解決です(初期のLpSpl / mTORC1対中期/後期のRavZ、SidE)。第二に、いくつかのオートファジー調節エフェクター(LpSpl、Lpg2936など)には、 in vivo 検証が欠けています。第三に、マクロファージサブセット、上皮、および好中球にわたる異食性応答の細胞型の不均一性は十分にマッピングされていません。エフェクターの作用を注文するために、時間分解感染アトラス(パルスチェイス、LC3リピドミクス、PR-ユビキチンプロテオミクス、ライブレポーター)を提案します。因果関係を確立するための細胞型特異的マウスモデルにおける対のエフェクター欠失株(Δ、ravZ / Δ、sidE / Δ、lpSpl / Δ、lpg2936)。シングルセル/空間マルチオミクスと、V-ATPase-ATG16L1軸、LRSAM1/パーキンタグ付け、およびアダプターモジュール(OPTN/NDP52/p62)に焦点を当てたCRISPR/perturb-seq。翻訳的には、RavZ(システインプロテアーゼ活性部位)またはSidE(mART/PDE PR-ユビキチン化)をブロックしてLCV上のLC3-IIプールとアダプター動員を回復するエフェクター指向性阻害剤と、カーゴタグ付け(LRSAM1/Parkinを活性化)、アダプター-LC3の結合を安定化し、フラックスを一時的に調整する宿主指向性ブースター(TFEB活性化、緩和されたmTORC1)を想定しています。肺標的送達(例えば、抗RavZ/SidE剤とTFEBアゴニストを組み合わせた吸入ナノ粒子)は、タイムスタンプ付きの細胞型分解読み出し(LC3フラックス、PR-Ub占有率、アダプター動員、融合指標)およびin vivo有効性(細菌量、病理学、生存率)によってベンチマークする必要があります。

L. ニューモフィラ は、主に貨物の認識、ユビキチン化、オートファゴソームの成熟、リソソーム融合を妨げる多様なエフェクタータンパク質を通じて、異食を回避するための一連の戦略を進化させてきました。これらのメカニズムにより、病原体が宿主細胞内で生存して複製できるだけでなく、オートファジー調節の新しい側面も明らかになります。これらの回避戦術を理解することで、宿主防御と微生物の適応の間の複雑な相互作用についての貴重な洞察が得られます。今後の研究は、追加のエフェクターの同定、その分子標的の解明、感染時の時間的調節の解明に重点を置く必要があります。さらに、これらのメカニズムの洞察を活用することで、異食機能を回復する宿主指向療法や新しい抗菌剤の開発を導く可能性があります。高度なイメージング、構造生物学、オミクス アプローチの継続的な統合は、 L. ニューモフィラ とオートファジー機構の間の動的な相互作用を分析するために非常に重要であり、細胞内病原体と戦うための革新的な戦略につながる可能性があります。

最後に、多くのレジオネラ菌エフェクターは多機能であり、オートファジーを超えて複数の宿主プロセスに影響を与えます。L. pneumophilaが異食を回避するのを助けるのと同じエフェクターは、宿主細胞死(アポトーシス)と免疫シグナル伝達経路を調節し、細菌の生存をさらに促進します23,30,35,44,45。オートファジー回避と他の宿主防御メカニズムとの間のこのクロストークは、レジオネラ菌の病原性戦術を総合的に研究する必要性を強調しています。オートファジー標的エフェクターがアポトーシスと炎症にどのように同時に影響するかを調査することで、宿主と病原体の相互作用をより包括的に理解し、治療介入の新たな標的を明らかにする可能性があります。

図1:異食のメカニズムの概略図。 細菌が細胞質に侵入すると、ユビキチンはユビキチンリガーゼによって病原体の表面または病原体に感染した液胞に存在するタンパク質に結合し、続いて病原体を包み込むユビキチンコートが形成されます。このユビキチンコートは、オートファジーアダプターを動員するためのシグナル伝達プラットフォームとして機能します。さらに、オートファジー受容体は、細菌のファゴソーム表面ガレクチンに結合するか、細菌の表面タンパク質と直接相互作用することにより、異食を開始できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:L.ニューモフィラエフェクターの異食回避戦略。この表は、選択されたL.ニューモフィラエフェクタータンパク質、それらの分子標的または活性、およびそれらが破壊する異食経路の段階を示しています。