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ソース: 研究所博士 b. ジル Venton - ヴァージニアの大学の
(紫外-可視) 紫外可視分光法は、それは非常に汎用性とほぼすべての分子を検出することができるので最も人気のある分析手法の一つです。紫外可視分光法、紫外-可視光が試料を通過、サンプルによる光の透過率を測定します。透過率 (T) から = ログ (T) として吸光度を計算できます。吸光度スペクトルが得られ、異なる波長で化合物の吸光度を示しています。任意の波長で吸光度の量は、分子の化学構造によるものです。
紫外-可視は、機能グループを識別または吸光度スペクトルを照合することによって化合物の id を確認する質的な方法で使用できます。試料の濃度はビールの法則を使用して吸光度に関連して、定量的な方法では使用もできます。紫外可視分光法を使用して、DNA や水の分析のため、各種クロマトグラフィーの検出器としてサンプルの蛋白質の量を定量化します。化学反応速度論も、時間をかけて繰り返し紫外-可視計測することで紫外可視分光法による測定されます。紫外-可視計測は、分光光度計で一般的に撮影されます。それは多くの化合物を検出できるため、紫外-可視は、またクロマトグラフィーなどの他の分析技術の非常に人気のある器です。
通常、紫外-可視は短いパスの長さにわたっていない多くの光が吸収されるため、最も敏感な分光法ではありません。蛍光など他の分光学の技術はより高い感度が、ほとんどの分子は蛍光ではないと一般にできるが。紫外可視赤外分光法などの他の吸光度測定に似たような感性があります。
1. 分光計をキャリブレーションします。
2. 吸光度スペクトルを実行します。
3 紫外可視分光法を用いた速度実験
紫外可視・紫外・可視分光法は、実験室で最も人気のある分析手法のひとつです。
紫外可視分光法の光は紫外線または可視スペクトル内の特定の波長でのサンプルを通じて渡されます。サンプルは、光の一部を吸収し、通過したり転送する光のすべてがなります。伝送は、入射光を透過光の強度比と吸光度に相関しています。吸光度を定量的な方法で使用して、サンプルの濃度を取得できます。また公開データへの吸光度スペクトルと呼ばれる波長の範囲で測定した吸光度を照合することによって化合物を識別するために質的な方法で使用ことができます。このビデオは紫外可視分光法を紹介し、サンプルの濃度と反応速度を決定する際に研究室での使用をデモンストレーションします。
光子は分子に当たるし、吸収は、分子はその基底状態から高エネルギーの状態に昇格します。2 間のエネルギー相違バンド ギャップであります。光子のエネルギー吸収する光子のためのバンド ギャップと一致する必要があります。化学構造決定バンド ギャップ;したがって分子ずつユニークな吸光度スペクトルがあります。
吸光度ビールの法則、どの状態の吸光度と等しいパスの長さと濃度モル減衰係数に従います。モルの減衰係数は特定の波長の光を吸収する個々 の化合物の能力に関連します。パスの長さは、標準キュヴェットのため 1 cm は、通常サンプルを通して光が旅した距離を指します。ビールの法律は、吸収率は知られている、または校正曲線を使用することができますサンプル濃度を計算する使用ことができます。
紫外-可視ほとんどの分子は紫外可視波長範囲の光を吸収すると一般的な手法と呼ばれます。UV 範囲 100-400 nm 400-700 nm の可視スペクトルの範囲からを拡張します。ただし、この範囲内の光源が高価なほとんど分光光度計は、100-200 nm の深い紫外範囲では動作しません。ほとんどの紫外可視分光光度計は、170-375 nm、350-2,500 nm からの光を生成する可視域用タングステン フィラメントのランプからの光を生成する紫外線の範囲の重水素ランプを使用します。
光源は通常広い波長範囲を持つランプなので特定吸収波長はフィルターまたは分光器を使用して選択されます。分光器は、波長の光を空間的分離と光の所望の波長が、出口スリットを配置しますデバイスです。モノクロ メーターははは、全体の吸光度スペクトルを提供するために波長をスキャンできます。これは技術を定量化し、分子の広い範囲を識別するのに便利になります。
紫外-可視分光学の基礎が記載されている、後は実験室で簡単な Uv-vis 実験を見ています。
測定を開始する前に、分光光度計をオンにし、それらを安定させるために時間の適切な期間のウォーム アップにランプを許可します。
サンプル溶剤できれいなキュベットを記入の空白の準備、任意の指紋を削除するリント フリー ペーパーで外側を拭き取ります。
キュヴェットがビームのパスのうち任意の溝の側面と正しく揃っていることを確認、それを分光光度計に挿入します。周囲の光がシステムに入るを防ぐために蓋を固定します。
空白または波長範囲にわたって 1 つの波長での吸光度を測定します。記録または、吸光度を付けてサンプルの吸光度からそれを減算する必要があります。
次に、空白を破棄、サンプルで 2 回キュベットをすすいでください。サンプルと完全な 3/4 のキュベットを埋めます。汚れや指紋がないことを確認するもう一度、キュヴェットの外側を拭いてください。
正しい方向に分光光度計のキュヴェットし、蓋を固定します。
空白として吸光度測定または同じ波長や波長範囲のスペクトルを収集します。楽器は自動的にこれを行う場合、空白スペクトルまたは測定を減算します。
収集された吸光度スペクトルから吸光度の最大値、または λmaxを決定します。
サンプルの analyte の量を定量化するには、既知濃度の範囲を使用して検量線を作成します。構築し、検量線を使用する方法の詳細については、このコレクションのビデオ「検量線」をご覧ください。
吸光度測定は、反応中の物質濃度の増減額増加を測定することにより反応速度の計算にも使用できます。開始のサンプルでは、最初の読み取りでは、反応前に、最大の吸光度でこの場合、色素を青します。
次に、すぐに、漂白剤は化学反応を開始する、この場合、試薬を追加します。サンプルと混合してよく、かき混ぜます。
時間をかけて最大吸光度吸光度を測定します。
青い色素サンプルの初期の吸光度スペクトルが表示されます。背景の色は、可視スペクトルの光の色を示します。ブルーの染料に吸光度の最大値は、約 630 nm。
青い染料と漂白剤との反応の速度は、時間の経過と共に測定しました。それは漂白剤と反応して、青色色素の吸光度が時間の経過と共に減少します。吸光度が 300 後にゼロ近くに達する s、反応が完了に近づいたことを示します。反応速度論と反応の詳細については、ビデオ「反応速度法」ゼウス科学教育を見てください。
紫外可視分光法は、特定またはサンプルを定量化する多くの様々 な研究分野で多用です。
たとえば、紫外可視分光法が多用生物分野のサンプルの蛋白質の量を定量化します。ブラッドフォードの試金は蛋白質、色素の助けを借りてを定量化するよく使用されます。まず、知られていた蛋白質濃度の検量線を準備、ウシ血清アルブミン、または BSA を通常使用します。Coomassie 青い汚れ、基準とサンプルが追加されます。595 タンパク質-色素錯体の吸光度を測定し、nm。
280 の吸光度から直接タンパク質を測定ことができる代わりに、nm。この例では、タンパク質濃度は、超低ボリューム分光光度計を使用して定量化されます。多くのタンパク質では、1 mg/mL の濃度に相関した 1 の吸光度。
紫外可視分光法また細胞培養の細菌細胞の量を定量化するために使用されます。600 で測定はこの測定、吸光度、または光学密度、nm。通常、1 測定外径600 mL あたり 8 × 108細菌細胞の存在を示します。文化の成長を通して細胞密度の測定により、細菌の増殖曲線の決定と文化がその急激な成長フェーズを識別するために助けることができます。
窒素酸化物や二酸化窒素、NOx、自動車の排気ガスの副産物は、有害なオゾンを形成するため、環境への害をすることができます。反応してx測れないことができますスルファニル酸とラウリン エチレンジアミン溶液とのそれ。得られた溶液は、強度を直接 NOx濃度に相関はピンク色アゾ色素分子です。この濃度は、紫外可視分光光度計を使用して決定することができます。
ゼウスの紫外・可視分光入門を見てきただけ。今、紫外-可視紫外-可視を使用してサンプルを測定するための方法とサンプルの濃度を吸光度を関連付ける方法の基本を理解する必要があります。
見てくれてありがとう!
紫外可視(UV-Vis)分光法は、研究室で最も人気のある分析手法の1つです。
UV-Vis分光法では、光はUV(可視スペクトル)の特定の波長でサンプルを通過します。サンプルが光の一部を吸収すると、すべての光が通過または透過するわけではありません。透過率は、入射光に対する透過光の強度の比であり、吸光度と相関しています。吸光度は、サンプルの濃度を得るために定量的に使用することができます。また、定性的な方法を使用して、吸光度スペクトルと呼ばれる波長範囲で測定された吸光度を公開データに一致させることにより、化合物を特定することもできます。このビデオでは、UV-Vis分光法を紹介し、ラボでのサンプル濃度と反応速度の決定にUV可視分光法を使用する方法を示します。
光子が分子に当たって吸収されると、分子は基底状態からより高いエネルギー状態に促進されます。2つの間のエネルギー差はバンドギャップです。光子が吸収されるためには、光子のエネルギーがバンドギャップと正確に一致する必要があります。化学構造によってバンドギャップが決まります。したがって、分子はそれぞれ固有の吸光度スペクトルを持っています。
吸光度はビールの法則に従っており、吸光度はモル減衰係数に経路長と濃度を掛けたものに等しいと述べています。モル減衰係数は、特定の波長の光を吸収する個々の化合物の能力に関連しています。光路の長さとは、光がサンプルを通過する距離を指し、標準的なキュベットでは通常1cmです。吸収率がわかっている場合は、ビールの法則を使用してサンプル濃度を計算することができます、または検量線を使用できます。
UV-Visは、ほとんどの分子が紫外可視波長範囲の光を吸収するため、一般的な手法と呼ばれることがよくあります。UV範囲は100〜400nm、可視スペクトルは400〜700nmの範囲です。ただし、ほとんどの分光光度計は、100〜200 nmの深紫外範囲では光源が高価であるため、動作しません。ほとんどのUV-Vis分光光度計は、170〜375 nmの光を生成するUV範囲に重水素ランプを使用し、350〜2,500 nmの光を生成する可視範囲にタングステンフィラメントランプを使用します。
光源は通常、波長範囲の広いランプであるため、特定の吸光度波長はフィルターまたはモノクロメーターを使用して選択されます。モノクロメーターは、光の波長を空間的に分離し、目的の光の波長がある場所に出口スリットを配置するデバイスです。モノクロメーターは、波長範囲にわたってスキャンして、全体の吸光度スペクトルを提供できます。これにより、この手法は、さまざまな分子の定量と同定に役立ちます。
紫外可視分光法の基本がわかったところで、研究室での簡単な紫外可視実験を見てみましょう。
測定を開始する前に、分光光度計をオンにし、ランプが安定するまで適切な時間ウォームアップします。
清潔なキュベットにサンプル溶媒を充填してブランクを準備し、糸くずの出ない紙で外側を拭いて指紋を取り除きます。
キュベットがビーム経路の外側に溝のある側面に適切に位置合わせされていることを確認し、分光光度計に挿入します。周囲光がシステムに入らないように、蓋を固定します。
ブランクの吸光度を1つの波長で測定するか、または波長範囲で測定します。サンプルの吸光度から吸光度を差し引く必要があるため、吸光度を記録または保存します。
次に、ブランクを捨て、キュベットをサンプルで2回すすぎます。次に、キュベットを約満たしますか?サンプルがいっぱいです。キュベットの外側を再度拭いて、キュベットがきれいで指紋が付いていないことを確認します。
キュベットを分光光度計に正しい向きで置き、蓋を固定します。
ブランクと同じ波長または波長範囲で吸光度測定値またはスペクトルを収集します。ブランクスペクトルまたは測定値を差し引いてください(機器が自動的に減算しない場合)。
収集した吸光度スペクトルから、吸光度の最大値、または最大値を決定します。
サンプル中の分析物の量を定量するには、既知の分析物濃度の範囲を使用して検量線を作成します。検量線の作成方法と使用方法の詳細については、このコレクションのビデオ「Calibration Curves」をご覧ください。
吸光度測定は、反応全体にわたる化合物濃度の増加または減少を測定することにより、反応速度論を計算するためにも使用できます。まず、反応前にサンプル(この場合は青色染料)を吸光度が最大になるように最初に読み取ります。
次に、試薬(この場合は漂白剤)をすばやく追加して、化学反応を開始します。サンプルと混ざるようによくかき混ぜます。
経時的な最大吸光度で吸光度を測定します。
青色色素サンプルの初期吸光度スペクトルが示されています。背景色は、可視スペクトルの光の色を示しています。青色染料は、約630nmで最大吸光度を有する。
青色染料と漂白剤との間の反応の速度論を経時的に測定した。青色染料の吸光度は、漂白剤と反応するため、時間の経過とともに減少します。吸光度は300秒後にゼロ近くに達し、反応が完了に近づいたことを示します。速度論と反応の詳細については、JoVE Science Educationのビデオ「Reaction Rate Laws」をご覧ください。
UV-Vis分光法は、サンプルの同定または定量化のために、さまざまな研究分野で多用されています。
例えば、UV-Vis分光法は、サンプル中のタンパク質の量を定量化するために、生物学分野で多用されています。Bradfordアッセイは、色素を用いてタンパク質を定量するためによく使用されます。まず、既知のタンパク質濃度の検量線を、通常はウシ血清アルブミン(BSA)を使用して調製します。次に、クマシーブルーステインを各標準試料とサンプルに加えます。次に、タンパク質-色素複合体の吸光度を595nmで測定します。
あるいは、タンパク質は280nmでの吸光度によって直接測定することもできます。この例では、超低容量分光光度計を使用してタンパク質濃度を定量化しています。多くのタンパク質では、吸光度 1 は 1 mg/mL の濃度と相関します。
UV-Vis分光法は、細胞培養中の細菌細胞の量を定量するためにも使用されます。この測定では、吸光度、つまり光学密度を600nmで測定します。通常、OD600 の測定値が 1 の場合は、1 mL あたり 8 x 108 個の細菌細胞が存在することを示します。培養増殖中の細胞密度を測定することで、細菌の成長曲線を決定でき、培養が指数関数的な成長段階にある時期を特定するのに役立ちます。
窒素酸化物と二酸化窒素(NOx)は、自動車の排気ガスの副産物であり、有害な対流圏オゾンを形成するため、環境に害を及ぼす可能性があります。NOxは、スルファニル酸とナフチル-エチレンジアミンの溶液と反応させることで測定できます。得られた溶液はピンク色のアゾ染料分子であり、その強度はNOx濃度と直接相関しています。この濃度は、UV-Vis分光光度計を使用して決定できます。
JoVEの紫外可視分光法の紹介をご覧になりました。これで、UV-Vis操作の基本、UV-Visを使用したサンプルの測定方法、および吸光度とサンプル濃度の相関方法を理解できました。
ご覧いただきありがとうございます!
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