5.10: 撤退の血私

1. レトロ軌道出血します。

1. 機器
   1. ベルジャー、または麻酔導入室、イソフルランなど麻酔ガスを管理するためを準備します。ガラスベル ジャーを使用すると、液体の麻酔薬は、皮膚からの吸収を避けるために、動物に接しないことが不可欠です。小さな穴をプラットフォームを使用することができます。
   2. 50-75 マイクロリットルを保持 Microhematocrit チューブが優先されます。マイラー ラップ管オペレーターの指の間を破る可能性は低く、安全対策として見なす必要があります。
   3. いくつかの紙タオルの厚さ、または他の絶縁材料は、プロシージャの間に動物の体の熱を維持するために作業面に配置されます。
2. 準備と動物の位置決め
   1. 動物は麻酔効果、ベルジャーやガスの麻酔誘導室におけるイソフルランなどの吸入麻酔します。
   2. 動物完全に麻酔をかけられ、それが削除され、外側臥床に配置。
   3. 目の爆風と、下顎の輪郭に沿って頭の上に指を置くことで、バックアップ上下の皮膚を引っ張るします。
   4. 崩壊または窒息によって死を引き起こす気道を閉塞する可能性、気管に圧力を適用することを避けるため。
3. 血液回収
   1. Microhematocrit、目の眼と鼻の面から 30-45 ° の角度で尾側監督します。
   2. ヘマトクリット管をゆっくり回転させながら圧力を適用します。結膜膜を切って、眼の神経叢を破壊します。
   3. 毛管作用によってヘマトクリット管に血液が流れます。
   4. 眼の空洞の後ろに骨を叩くので、深いプッシュされないように。
   5. 血は流れを開始、一度はみ出した目を維持する圧力を維持します。
   6. 血の複数のチューブを収集する必要はありません眼神経叢に次の管を配置する、血は流れ続けますと眼から来て収集することができます。
   7. 出血を止める、皮を解放でき、目正常な位置に戻ります。止血を確認するために軌道に圧力を適用されます。

図 1。マウスでレトロな軌道血回収。

2. 尾ブリード プロシージャ: 尾ちょきんと尾ニック

1. 機器
   1. 生殖不能のメスの刃、好ましくは 11 番ブレードまたは片面かみそりの刃は、尻尾切り取り領域法の最初の切断に使用されます。はさみでカットを粉砕すると、凝固し、血流を減らすことを促進するため、はさみを使用されませんする必要があります。尾ニック プロシージャ数 11、または 15 のメス刃がカットをすること使用されます。
   2. マウスの尾にアクセスできる拘束チューブを用意しています。
   3. 吸水紙タオルやガーゼは、尻尾切り取り領域を実行するため、基板として使用されます。
   4. ヘマトクリット管の収集も必要です。
   5. Styptic 粉は止血のために使用する必要があります。
2. 拘束
   1. 動物は、尾がアクセスできるようにチューブに配置されます。ブルーム型 restrainers の動物では、チューブにまず尻を引かれます。その他の管の動物の頭を最初に置きます。
   2. 動物は、その好転したり、尻尾を撤回できない管に保護されます。
   3. 粗面をつかむために許可されている場合、いくつかのマウスは最小限のマニュアル抑制とテールちょきんと血液コレクションになります。
   4. いくつかのラット血のコレクションのこのメソッドの吸入麻酔が必要になります。
3. 血液回収
   1. 尾は残骸を削除し、わずかな血管拡張を引き起こすぬるま湯で拭いてください。お湯を使用しないでください。
   2. 尻尾切り取り領域のテールを延長して尾 (0.5-1 mm マウス用とラット用 mm 2 まで) の非常に端をメス刃で切る。
   3. 尾尾ニックネームを延長して約 2/3 のメス刃でカットをしている尻を外側尾静脈の真上からの距離。
   4. 血流を促進する先端に尻から尾の境界線が描画できます。ただし、これはサンプルの品質を低下します。
   5. 血がヒントまたはヘマトクリット管を使用してニックから収集またはコレクションのバイアルに滴る。

3. 心臓採血

1. 機器
   1. マウスを 3 cc 注射器針 1"x 22 25 ゲージをお勧めします。小さい注射器には同じ背圧がなくより困難な血の撤退を確認することができます。針は 25 ゲージより小さい増加凝固血液の流れを制限して血液細胞にダメージを与えます。1"より短い針は、横隔膜から近づいていく心のレベルを達することができません。
   2. ラット x 1.5"針 18 ゲージで 10-12 cc 注射器が適しています。ラットのサイズ、に応じて、収集する全体の血液量を保持するかもしれない小さい注射器、従って注射器の処理中に変更するでしょう。20 ゲージより小さい針は、増加血液凝固に至る、血液の流れを制限します。横隔膜から近づくとき針未満 1.5」は心のレベルを達することができません。
   3. 十分なサイズの採血管は、集められた血を保持するために使用されます。
2. 拘束
   1. 適切な拘束は、このメソッドの成功に不可欠です。動物は、垂直にぶら下がって体と首筋が開催されます。本体は中心部のたわみや胸のねじれを防ぐためにまっすぐであることが重要です。
   2. 代替位置は、左のわき腹の肋骨の間針を置き背臥床です。これは非常に大きなラットまたは複数の動物が抽気される場合に特に便利です。

図 2。マウスの心臓血回収は垂直に開催。

3. 血液回収
   1. 首筋をマウスまたはラットが縦向きの場合より簡単に横隔膜を貫通、後面からアプローチできるからです。
      1. 針がちょうど動物の剣の左に切り込みに進んでいます。
      2. 針は背骨に平行でなければなりません、肋骨のすぐ下に配置します。
      3. 中心部が肘のレベルにおよそあります。
      4. 針を置き、胸に、ベベル中心部を穿刺します。
      5. 注射器でわずかなバック プレッシャを適用します。中心部に針がある場合は、血液が注射器に流れます。
      6. 血液が注射器に追加の背圧を追加する前に、シリンジをいっぱいまで待ちます。
   2. 動物の左側から側方進入背臥床での動物の配置が必要です。
      1. エントリ ポイントは、胸部に肘のポイントに対して測定されます。中心部が肘のレベルにおよそあります。
      2. 針は胸壁のポイント中間でテーブルの平面に垂直に挿入された dorsoventrally を測定です。
      3. 針を置き、胸に、ベベル中心部を穿刺します。
      4. 注射器でわずかなバック プレッシャを適用します。中心部に針がある場合は、血液が注射器に流れます。
      5. 血液が注射器に追加の背を追加する前に、シリンジをいっぱいまで待ちます。

図 3。背臥床位置でマウスと心臓血回収。

4. 技術的なヒント
   1. 正常な心臓は左を指している頂点が位置しています。まれに、心臓が反転されるので、中心部に穴を開けるの困難を伴います。
   2. 注射器に過度の背圧針ベベルを遮蔽と注射器への血流を停止、心に崩壊するかもしれない。
   3. 背圧と繰り返し、それを解放、注射器で血液凝固が開始されますを適用します。
   4. 肝臓に優しく圧力をかけて強制的に撤退可能にする循環系に追加血液量できます。

4. 後部上大静脈血撤退

4. 機器
   1. 25 29 g 針付き TB 注射器は、マウスの採血に使用されます。ラット、22-25 ゲージ針 1"x と 10-12 cc 注射器が必要です。
   2. 手術のプラットフォーム、郭清のトレイ、または動物を保護する他の表面に必要な関係、テープ、またはピンの位置に手足を押さなければなりません。
   3. 注射麻酔や麻酔は必要。吸入麻酔を使用している場合それは麻酔薬を鼻の円錐形の精度気化器を介して配信されることが望ましいです。プロシージャの長さは、追加の麻酔ガスの配達せず誘導チャンバーを使用しても、動物が復活する前に血の撤退を完了するための十分な時間は得られないようです。
   4. マウスのアイリスはさみや、ラットの手術室シャープ鈍はさみ、必要ですに沿って小さな非外科的親指鉗子と 2"x 2"ガーゼ スポンジ。
5. 拘束
   1. ときにつま先ピンチまたは尾ピンチによって決定される、動物完全に麻酔をかけられ、動物は背臥位に。
   2. 手足は、テープやピンでプラットフォームに固定されます。手足は、身体から拡張する必要があります。
6. 撤退
   1. 皮膚を持ち上げて、女性の骨盤のすぐ上またはすぐ上男性の包皮の皮膚を通して作られる小さな横カット。
   2. はさみのポイントは、カットに配置され、正中切開は、剣に骨盤/包皮から皮膚を介して行われます。
   3. 皮膚は、それぞれの側に横方向に反映されます。鈍的切離基になる筋肉から緩める必要があります。
   4. 筋肉を持ち上げたし、皮膚切り取り上筋小横のカットが行われます。
   5. はさみのポイントは腹部に配置され、剣への筋肉を介して正中切開を作成します。はさみのポイントすべての器官を切断を避けるために上向きの角度を必ず。
   6. 両側の肋骨の曲線に沿って横にカットします。肝臓を穿刺しないように余分な注意を行使します。
   7. 優しく腸を後部の上大静脈を公開する動物の左に移動します。
   8. 肝臓にガーゼのパッドを配置し、肝臓に人差し指と中指を休ませます。
   9. もう一方の手で、針を挿入し、腎血管の接合部と腸骨の分岐上大静脈の中間に上向き、ベベルします。
   10. ゆっくりと肝臓に加圧しながら血を撤回します。

図 4。後部下大静脈から血液回収。

採血は、マウスやラットを含むいくつかの調査研究の一般的な要件です。これらの動物の採血方法の選択は、必要な血液の量、サンプリングの頻度、出血する動物の健康状態、技術者のスキルレベルなど、多くの要因によって異なります。

ここでは、これらの考慮事項を確認し、眼窩後眼窩の出血、尾部の切り傷と傷、心臓内採血などの採血手順を概説します。その他の方法については、このシリーズの 2 番目のビデオを参照してください。

採血プロトコルを掘り下げる前に、まず、サンプルの種類、針の選択、収集できる最大血液量など、いくつかの一般的な考慮事項を確認しましょう。マウスまたはラットから血液を採取する前に、必要な血液サンプルの種類を決定する必要があります。実験手順では、全血、血漿、または血清が必要になる場合があります。

全血を採取する場合は、凝固を防ぐために抗凝固剤をサンプルに添加する必要があります。一般的に使用される抗凝固剤には、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、およびエチレンジアミン四酢酸(EDTAと略されます)が含まれます。抗凝固剤をシリンジに直接装填して、表面をコーティングすることができます。これにより、血液が採取されるときに抗凝固剤に直接接触することができ、凝固の予防に役立ちます。げっ歯類の血液は急速に凝固するため、血液に対する抗凝固剤の正しい比率を使用することが不可欠です。血漿採取には、全血を抗凝固剤で遠心分離する必要があります。スピン後、WBCと血小板層の上にある半透明の液体がプラズマです。フィブリノーゲンやその他の凝固因子が含まれています。一方、血清は抗凝固剤を含まない全血サンプルから採取されます。また、サンプルが凝固しているため、トッププレーヤーである血清にはフィブリノーゲンやその他の凝固因子は含まれていません。

針の選択は、動物のサイズと静脈穿刺の部位に基づいています。一般に、大口径の針は血球への損傷が少なく、より迅速な採血を可能にします。しかし、船舶の損傷を引き起こす可能性が高くなります。針の長さも考慮する必要があります。針が長すぎると、使いにくくなったり、針の中にいる間に血液が固まり始めたりする可能性があります。サイズの選択肢は、18〜29ゲージ、長さ0.5〜1.5インチの範囲です。各方法の適切な針のサイズについては、手順のセクションで説明します。

最後に、げっ歯類のサイズが小さいため、1回の採血で収集できる血液の量が最大であり、生物に深刻な害を及ぼすことはありません。採血は、体液補充の有無にかかわらず、通常は0.9%生理食塩水を使用して行われます。それぞれの場合の上限は、以下のテキストプロトコルに記載されています。さらに、一部の実験では複数のサンプルを収集する必要があり、そのような場合、液体の補充動物と一緒に、血液細胞を補充するためにも時間を要します。繰り返しになりますが、シリアルコレクション中に収集できる最大量があり、上限は以下のプロトコルに記載されています。

いくつかの一般的な考慮事項を検討した後、科学者が目の近くの血管から少量を収集するために使用する技術である眼窩後出血から始めて、特定の血液採取技術に飛び込みましょう。眼窩領域の解剖学的構造は、マウスとラットで異なることに注意してください。ラットには目の後ろを流れる血管の神経叢がありますが、マウスには後眼窩洞を作成する血管の集まりがあるため、マウスでこの手順を簡単に実行できます。

採血用のチューブをつかむことから始めます。50〜75マイクロリットルを保持するマイクロヘマトクリットチューブが好ましい。作業面にいくつかのペーパータオルまたはその他の断熱材を置きます。これは、手術中に動物の体温を維持するためです。次に、イソフルランなどの吸入麻酔薬を使用して動物に麻酔をかけます。動物が完全に麻酔されたら、動物をチャンバーから取り出し、横臥位にある横向きに置きます。次に、頭のてっぺんと顎のラインに沿って指を置き、皮膚を前後に引っ張って目の突出を誘発します。気管に圧力をかけると、窒息死の原因となる可能性があるため、避けてください。その後、マイクロヘマトクリットチューブを眼の内側眼角に配置し、鼻の平面から30〜45度の角度で尾側に向けます。.チューブをゆっくりと回転させながら圧力をかけます。これにより、結膜が切断され、眼神経叢または副鼻腔が破裂します。血液は毛細血管の作用によりヘマトクリット管に流れ込みます。チューブを深く押しすぎて眼腔の後ろの骨にぶつからないようにしてください。血液が流れ始めたら、目が突き出たままになるように圧力を維持します。出血を止めるには、皮膚を解放し、目を正常な位置に戻します。止血を促進するために圧力をかけます。サンプル採取を繰り返す場合は、ブリードの間隔を空けて10日以上空けてください。これにより、組織が治癒する時間が得られます。

眼窩後出血は一般的な手順ですが、その人道性については多くの懸念があります。これらには、ヘマトクリットチューブの過度の動きによる腫れが含まれます。これにより、眼球の突出が発生し、まぶたの閉鎖が妨げられ、角膜の乾燥、損傷、痛みを引き起こし、引っかき傷や自傷を引き起こす可能性があります。ヘマトクリット管の不適切な配置は、視神経を切断し、失明を引き起こす可能性があります。別の考えられる合併症は、目が眼窩から押し出され、まぶたが眼球の後ろに落ちることです。さらに、壊れやすい眼窩骨の骨折、眼球の貫通による硝子体液の喪失、または眼の後ろの血腫の形成による極度の痛みから問題が発生する可能性があります。これらすべての懸念にもかかわらず、熟練した技術者が手順を実行し、動物が完全に麻酔されている場合、眼窩後出血はげっ歯類の採血の効果的な方法です。

次に、少量の連続サンプルの収集を可能にする尾出血の考慮事項と手順を確認しましょう。この手順に必要な機器には、滅菌番号11メスが含まれます。ハサミで切った切り口がつぶれ、凝固を促進し、血流を減少させる可能性があるため、ハサミは使用しないでください。他の器具は、動物の尻尾へのアクセスを可能にする拘束チューブです。吸収性ペーパータオル;コレクションまたはヘマトクリットチューブおよび止血薬 - 止血を助けるため。

まず、動物を拘束チューブに固定します。次に、尾をぬるま湯で拭いて破片を取り除き、わずかな血管拡張を引き起こします。お湯は使用しないでください。尻尾を伸ばし、メスの刃で尻尾の一番端を切り取り、ヘマトクリットまたは収集チューブを使用して血液を採取します。尻尾を撫でたり、尻から先端まで「搾乳」したりして、血流を促進することができます。ただし、これによりサンプルの品質が低下します。

出血を止めるには、ガーゼパッドでテールチップに圧力をかけます。止血を達成するために、septical粉末を使用してもよい。5〜10分ごとに動物をチェックし、止血が達成されたことを確認しますが、これは繰り返しサンプリング後に遅れる可能性があります。テールスニップから採取されたサンプルには、動脈血と静脈血の両方が含まれ、組織製品の汚染も含まれている可能性があります。ただし、この採血の手順は、尾の端にある元の切り傷のかさぶたまたは血栓を破壊することにより、連続採血を可能にします。

テールスニップに代わる採血方法は、尾部血管のニックで、これは比較的侵襲性が低いです。このためには、同じメスの刃を使用して、臀部からの距離の約3分の2である外側尾静脈に直接小さな切り込みを入れます。テールスニップと同様に、血液は収集チューブまたはヘマトクリットチューブに収集できます。また、部位に圧力をかけ、5〜10分ごとに動物を再チェックすることにより、止血を確保することが不可欠です。ただし、テールスニップと同様に、サンプルはティッシュ製品で汚染されている可能性があります。

多くの場合、非生存性の大きな血液サンプルを必要とする研究が行われ、これは心臓内出血または尾側大静脈による放血によって達成されます。

マウスの心臓内法には、22-25ゲージの1インチ針が付いた3ccの注射器が必要です。また、ラットの場合は、18ゲージの1.5インチの針が付いた10〜12ccの注射器が好まれます。これらのニーズとシリンジが理想的な理由を理解するには、以下のプロトコルを参照してください。

まず、二酸化炭素を使って動物を安楽死させることから始めます。安楽死後、体を垂直にぶら下げた状態でげっ歯類を首筋で保持します。心臓のたわみや胸のねじれを防ぐために体をまっすぐにする必要があるため、この拘束は重要です。心臓はほぼ肘の高さに位置していることに注意してください。挿入側は、剣状突起のすぐ左側、脊椎に平行、肋骨の下にあるノッチにあります。

針を胸に挿入し、斜めにして心臓に穴を開けます。シリンジでわずかな背圧をかけます。針が心臓にある場合、血液は注射器に流れ込みます。血液がバレルを満たすまで待ってから、背圧を追加します。全血液量の約半分は、心臓穿刺によってマウスまたはラットから収集できます。これは、平均的なマウスの約1 mLの血液と平均的なラットの約10 mLの血液に相当します

横方向のアプローチを使用する場合の背側臥位も代替の姿勢です。この場合、動物の左側の肋骨の間に針を置きます。入口は、胸壁の肘の点に対して測定されます。針を斜めに、胸壁の中間点でテーブルの平面に対して垂直に挿入します。シリンジでわずかに背圧をかけます。針が心臓にある場合、血液は注射器に流れ込みます。繰り返しになりますが、血液がバレルを満たすまで待ってから、背圧を追加します。どちらの位置でも、過度の背圧により心臓が崩壊し、針の斜角が閉塞し、注射器への血流が停止する可能性があることに注意してください。

心臓の血液を採取する別の方法は、尾側大静脈を使用することです。この手順に必要な機器は、正しいサイズの針が取り付けられた適切な注射器です。腹腔を開くためのはさみ、小さな非外傷性親指鉗子、ガーゼスポンジ。この技術では、動物を深く麻酔し、処置全体を通して麻酔下で維持する必要があります。CO2ナルコーシスは、動物の心臓が鼓動している必要があるため、選択肢にはありません。動物を背側横臥位に置き、手足をプラットフォームに固定します。手足は体から離れて伸ばす必要があります。

次に、鉗子で皮膚を持ち上げ、はさみを使用して、女性の骨盤のすぐ上の皮膚または男性の包皮に小さな横方向の切り込みを入れます。次に、はさみの先端を切り口に入れ、骨盤または包皮から剣状突起までの皮膚を通して正中線を切開します。皮膚を横方向に反射させた状態で、筋肉を持ち上げ、皮膚の切り傷のすぐ上に筋肉を横切って小さな切り込みを入れます。

はさみの先端を腹部に配置し、筋肉から剣状突起まで正中線を切開します。臓器を切らないように、ハサミの先を上に傾けてください。両側のリブの曲線に沿って横方向に切ります。肝臓に穴を開けないように注意してください。腸を動物の左側にそっと動かして、後大静脈を露出させます。肝臓にガーゼパッドを置き、人差し指と中指をその上に置きます。もう一方の手で針を挿入し、腎血管の接合部と腸骨分岐部の中間にある大静脈に面取りします。肝臓に圧力をかけながらゆっくりと血液を採取します。

手の動きは、血管の破裂を引き起こす可能性があるため、避けてください。また、採血が早すぎると、血管が斜角につぶれて開口部が閉塞し、採血が妨げられる可能性があります。この技術の主な利点は、針が皮膚を通過しないため、滅菌サンプルを収集できることです。

最後に、これらの採血技術のいくつかの応用例を見てみましょう。がん免疫学は新しい分野であり、この分野の研究者は、がん発生のさまざまな段階で免疫細胞を研究するために採血を行うことがよくあります。例えば、ここでは、研究者たちは、腫瘍生着後10日、20日、30日後に好中球を分離し、定量するために、がん性マウスから心臓の血液を採取しました。

一方、血液組成は生理学者によって頻繁に研究されています。この研究と同様に、研究者は糖尿病動物の腎機能の評価に関心を持っていました。そのために、これらの科学者たちはまず、糖尿病動物モデルに染料を注入しました。次に、テールスニップ法を用いて複数の時点で採血し、血液中の色素濃度を評価し、最終的に糸球体濾過率を算出し、糖尿病導入後の腎機能の違いを浮き彫りにしました。

最後に、幹細胞の研究者は血液サンプルを使用して、ドナー細胞がレシピエントのシステムに組み込む成功を評価します。ここで、研究者は最初に、尾静脈注射を介して、雄マウスの骨髄細胞を野生型および遺伝子組み換え雌動物に移植しました。次に、レシピエントマウスの後眼窩洞から血液を採取し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて血液細胞のゲノムDNAを研究しました。これにより、2種類の動物におけるドナー細胞の生着の割合が得られた。

JoVEの血液離脱技術に関する第1回をご覧になりました。シリーズの次のビデオで、実験動物で一般的に使用される他の採血技術の実行方法を確認してください。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!