IVISスペクトラムを用いた乳腺腫瘍の in vivo生物発光イメージングに

ルシフェラーゼを発現する乳腺腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、縦断的研究で、非侵襲的に腫瘍の成長と発展を監視する光イメージングを用いて可視化されています。

この手順を開始するために、乳腺腫瘍細胞株を発現するルシフェラーゼを凍結茎から解凍し、培養して90%COFの流暢さまで拡大します。次いで、懸濁細胞の段階希釈を96に播種する。ウェルプレートをルシフェリアンに曝露し、次に500光子を超える蛍光発光を生成する最適な細胞数をプレートを使用して決定し、リーダー細胞を動物の側面に皮下に注入し、次にルシフェラーゼを注入します。

腹腔内細胞は、Luciferの投与後10分という早い時期に画像化でき、腫瘍塊は壊死の発症までin vivoで最大1か月視覚化できます。こんにちは、カリフォルニア州アラメダにあるCaliper Life Sciencesのイメージング研究所のEd Limです。今日は、生物発光を使用してマウスの腫瘍増殖を非侵襲的にモニタリングする手順を紹介します。

この手順は、私たちの研究室と世界中のivus研究室で、特に薬物化合物による治療後の腫瘍の成長と発達を研究するために使用されています。それでは始めましょう。この手順は、マウスに注射するための腫瘍細胞株を準備することから始まります。

細胞株を発現するルシフェラーゼを幅広く取り揃えており、生物発光前臨床試験に使用することができます。これらの細胞は病原体を含まない凍結培養物として提供され、選択マーカーを必要とせずに標準的な培地で容易に増殖します。私たちの実験では、遺伝子発現または腫瘍形成の光学的指標として機能するルシフェラーゼ遺伝子を発現する41 Luke 2マウス乳腺腫瘍細胞株を使用します。

In vivoでは、ルシフェラーゼの発現を使用して原発腫瘍の成長を非侵襲的に追跡しますが、転移性病変の特定と監視にも使用できます。ルシフェラーゼ活性は注射前に確認する必要があり、これを行うために、90%コンフルエントフラスコをトリプシンで回収し、カウントします。その後、50,000個の細胞をマイクロタイタープレートの1つのウェルに分注し、段階希釈を行います。

ルシファーを1ミリリットルあたり150マイクログラムでウェルに加え、2分間インキュベートします。マイクロプレートは、ivusまたは発光プレートリーダーで画像化して、発現レベルを判断できます。この細胞株は、細胞あたり毎秒最大6, 500光子を発現しますが、細胞あたり毎秒30光子を超える発現レベルは、in vivoで成功裏にイメージングできます。

最適な活性の細胞ができたので、皮下注射のステップに進むことができます。腫瘍の最適な検出を容易にするために、胸腺免疫不全のヌードマウス株を使用しています。注射に先立ち、動物は深部麻酔のために3%ISOフッ素を用いて5分間麻酔をかけます。

次に、100マイクロリットルのPBSに250, 000個の細胞を皮下注射します。細胞を1ミリリットルの注射器に装填し、26ゲージの針を取り付けます。鉗子で皮膚をやさしく持ち上げてテントを作り、基部に細胞を注入します。

新たに注入された細胞は、すぐに画像化することができます。次に、体重1キログラムあたり合計150ミリグラムのルシファーが、腹腔への2回の注射を通じて投与されます。.この研究では、ルシフェリアン注入の10分後に動物を画像化し、一貫した光子束を確保します。

これについては、次の手順で説明します。私たちの実験では、IVUSスペクトルin vivoイメージングシステムを使用します。これは、摂氏マイナス90度に冷却された逆部間引き電荷結合デバイスを使用して最大感度を達成します。絶対定量をサポートするために、システムはダウンタイム中にダークチャージを測定し、初期化中にセルフキャリブレーションを実行します。

イメージングを開始するには、IVUSシステムを初期化し、実験のイメージングパラメータを設定します。視野を選択します。イメージングする動物の数に対して、一体型麻酔マニホールドを使用して最大5匹の動物を装置内に維持することができます。

ステージは、動物の体温を維持するために摂氏37度に一定しています。EKGポートは、生体画像ソフトウェアの曝露、時間Fストップ、およびpix結合でのストレスの多い手順中に動物の健康状態を監視するために提供され、細胞株の発現レベルに基づいて最適化できます。これらの設定は、定量結果に影響を与えることなく、実験中にいつでも変更できます。

Ivusは、白色光の下での動物の写真画像を定量的な生物発光または蛍光シグナルで取得し、それを画像に重ね合わせると、生物発光シグナルは光子/秒で表現され、強度マップとして表示されます。画像表示は、定量に影響を与えることなく、画像に最適なコントラストと解像度を提供するように調整されます。細胞からの発光は、目的領域を使用して注入部位で測定できます。道具。

測定データは、画像キャプチャに関連するすべての実験パラメータとともにテーブルに表示され、保存またはエクスポートできます。解析のために、複数の画像を取得して比較し、実験の性質に応じて数秒または数か月にわたる縦断的研究を行うことができます。タイムゼロで腫瘍からの光子束を測定し、4週間監視します。

隔週間隔でのイメージングでは、腫瘍からの光子フラックスは、ルシフェラーゼを発現する生細胞の数に比例します。したがって、生物発光は、移植後5日で腫瘍のサイズと直接相関します。腫瘍はまだ触知可能ではありませんが、細胞は生物発光によって定量化でき、腫瘍は活発に成長していることがわかります。

この段階では、生物発光シグナルははるかに強力です。露光時間のF値とピクセルスピンを調整して、画像が鮮明になり、カメラが飽和しないようにすることができます。IVUSは、集光の変化を自動的に補正します。

したがって、これらの測定値は、以前に収集されたものや後で収集されたものと比較できます。実験で。移植後15日で腫瘍は触知可能であり、生物発光測定はすでに15日間のデータを生成しています。

28日で、着床後の腫瘍は壊死し始め、細胞は死に始めます。ノギス測定で推定した腫瘍の大きさはそれほど変化しませんが、腫瘍からの発光は減少します。細胞死の口径と生物発光の測定は、人道的なエンドポイントに到達するまで続けることができます。

低酸素症または治療レジメンによる腫瘍壊死は、腫瘍量を減少させない場合でも、生物発光の減少によって示されます。生物発光イメージングを用いた単純な異種移植マウスモデルである皮下腫瘍の発生をモニタリングする方法を紹介しました。この手順を行うときは、移植前に細胞の発現レベルを確認することを忘れないでください。

次に、再現性を最大限に高めるために、ルシフェリアン注射後最適なタイミングで動物を画像化します。この方法の感度により、腫瘍はキャリパーで確実に測定できるようになるずっと前に生物発光によって測定できるため、腫瘍の発生を早期に監視することができます。各段階でイメージングパラメータを最適化することを忘れないでください 発光シグナルは飽和しませんが、発光により、動物を数ヶ月間定量的に監視し、寛解と再発の影響を研究することができます。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。