成体ラットの心筋細胞の初代培養

本稿では、成体ラットの心筋細胞を分離、培養に一般的な方法を説明した。コラゲナーゼとプロテアーゼは、単一の心筋細胞を消化して単離するために使用されています。心筋細胞は、ほとんどの実験の要件を満たすこのプロトコルに従って培養した。

この手順は、成体のラットから心臓を切除し、灌流システムに吊るすことから始まります。酵素溶液を約30分間灌流させた後、心臓を切除する。ミンチおよび酵素的消化は、小さなビーカーで継続することを可能にしました。

消化の終わりに、細胞は機械的攪拌によって単一細胞懸濁液に解離され、滅菌チューブにろ過されます。初代心細胞をカルシウム濃度を上昇させたバッファーで3回洗浄し、培養液に再懸濁し、培地に戻し、ラミネートコーティングした組織培養皿に播種します。こんにちは、コロンビア大学生理学・細胞物理学部のヘンリー・コーワ研究室のシャヒです。

今日は、他のラットの心臓細胞を分離して培養する手順を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して心臓のカルシウムチャネルを研究しています。それでは始めましょう。

ラット手術の前日は、すべての溶液が作られていることを確認してくださいが、まだ酵素を追加しないでください。バッファーA、B、および洗浄バッファーはすべて、摂氏4度で保存する前に無菌性のためにろ過する必要があります。6、ウェル組織培養プレートは、前日にラミネート溶液で播種し、CO2インキュベーターで摂氏37度で保存する必要があります。

手術当日。クランプハサミと鉗子を70%エタノールで消毒して手術器具を準備し、ペーパータオルで乾かします。半ミリリットルのヘパリン溶液で満たされた1ミリリットルの注射器が準備されます。

今では、70%エタノールを通過する灌流装置を蠕動ポンプで逆に洗浄することをお勧めします。終了したら、エタノールですすいで、二重蒸留水で装置をすすぎ、最後に緩衝液A.Theの流れをビーカーに集め、摂氏37度の水浴に入れます。クリーンアップされた灌流装置を調製するために、右側のシリンジチューブに40ミリリットルの緩衝液Aを、左のシリンジチューブに40ミリリットルの緩衝液Bを充填し、緩衝液Aが装置内を流れるようにして、カテーテルの先端まで灌流チューブをプライムした。

バッファーにシリンジを40ミリリットルレベルまで補充します。このステップの後、チューブに気泡が閉じ込められていないことを確認し、今度は緩衝器を止め、ストップコックバルブ付きのシリンジを止め、プロフュージョンチューブが今バッファB.Theプロフュージョン装置でプライミングされるようにプロセスを繰り返します。Bストップコックバルブが開いていますが、流れが止まっています。

IVラインのレギュレーターを使用して、収集ビーカーに流れるバッファーを廃棄します。手術前に最後に行うことは、必要な酵素をストック溶液に追加し、前日に他の溶液をろ過したのと同じように酵素溶液をろ過することです。ろ過後、この溶液は標準プロトコルに従って室温で放置できます。

ガス室でラットをイソフッ素で安楽死させます。胸部の切開部を70%エタノールで消毒します。ハサミを使って胸を開き、心臓を露出させます。

左心室に0.5ミリリットルのヘパリン溶液を注入します。大動脈の大部分を無傷のまま心臓を摘出します。すぐにカテーテルを大動脈に挿入します。

典型的なラットの心臓は、健康な桿状筋細胞の高い割合と、丸みを帯びた死んだ細胞をほとんど産み出さないはずです。次の手順が適切に遵守されている場合は、大動脈をカテーテルにクランプし始めます。カテーテルの先端を心臓に押し込みすぎないようにして、冠状動脈を介した心臓の良好な灌流を確保します。

クランプしたら、縫合糸で大動脈をカテーテルに結び付けます。次に、IVラインレギュレーターを開いて、ドリップ速度を速くし、バッファービーの洗浄中にバッファービーが心臓を洗い流すようにします。小さなハサミと鉗子を使用して、心房と心臓にしがみついている脂肪組織や肺組織を取り除きます。

バッファBが終了したら、しばらくの間、フローをバッファに切り替えます。バッファー A は 5 分間流れることができます。酵素溶液を摂氏37度の水浴で温めます。

緩衝液Aがシリンジから枯渇しているが、増殖装置のシリンジA中の酵素溶液50ミリリットルのチューブ負荷中にまだ存在する場合。今度は、酵素溶液が心臓に浸透するまで、水浴中のコレクションビーカーから流れるすべての流れを捨てる必要があります。酵素溶液が心臓に浸透したらすぐに、酵素溶液を収集ビーカーから補充された注射器に移すようにセットアップされている蠕動ポンプを作動させます。

A:酵素溶液が心臓を10分間流れるようにします。心臓が消化するにつれて、シリンジAの酵素溶液に0.1モルの塩化カルシウムが37.5マイクロリットルになると肥大化して見え始め、有効濃度の0.1ミリモルカルシウムが得られます。これは、10分後に濃度を増加させるために使用されるいくつかの塩化カルシウム添加の最初のものであり、シリンジAに0.1モルの塩化カルシウムを追加で50マイクロリットル追加することにより、カルシウムの濃度を0.2ミリモルに増加させ、さらに10分間増殖を進行させます。

10分が経過したら、心室を切り取り、ビーカーに20ミリリットルの酵素溶液が入った小さな滅菌ビーカーに心臓を移します。0.1モルの塩化カルシウムをさらに40マイクロリットル追加してカルシウム濃度を0.4ミリモルに増やし、小さな滅菌ハサミで心臓を10個以上にやさしくミンチします。次に、ビーカーを摂氏37度で穏やかに揺らしながらインキュベートします。

5分間のインキュベーション後、40マイクロリットルの0.1モル塩化カルシウムを添加して有効濃度0.6ミリモルカルシウムにし、プラスチック製のトランスファーピペットで心臓片を3〜5回静かに反復し、摂氏37度でさらに5分間インキュベートした後、40マイクロリットルの0.1モル塩化カルシウムを加え、前と同じように穏やかに反復します。滅菌済みの500マイクロメートルフィルターを使用して、消化された単一筋細胞を未消化の結合組織から分離します。細胞を室温で50ミリリットルのチューブに10分間沈殿させますジャークは、転写VIで上清を廃棄します 細胞を洗浄バッファー番号1に穏やかに再懸濁し、細胞が沈殿している間、細胞を室温で10〜20分間沈殿させます。

少量のアリコートを取り、この機会を利用して、倒立顕微鏡下で懸濁液中の細胞の品質と生存率を評価します。優れた製剤は、鮮明な縞模様を持つ細胞のような棒の割合が高いでしょう。細胞が落ち着いたら、スナットを廃棄し、細胞を洗浄バッファーに穏やかに再懸濁します。

その2、細胞を室温で沈殿させ、これも10〜20分かかり、上清を捨てます。細胞を組織培養プレートに移す前に、細胞を5%血清培地に穏やかに再懸濁します。1つのXSFMでプレートを洗浄します。

細胞を所望の密度で移し、CO2組織培養インキュベーターでインキュベートします。3〜5時間、培地を1つのXSFMに切り替えます 細胞は最大4日間培養し、必要に応じて実験に使用できます。プロトコルが正しく行われると、倒立顕微鏡下で70%以上の生きた心筋細胞が存在するはずです。

これらは、48時間培養した後にYFP REMをトランスフェクトした単離された筋細胞です。この品質の細胞は、通常、この手順で培養されます。私たちはただ単離する方法をお見せします、そして培養物はその熱い細胞です。

この手順を実行するときは、できるだけ迅速かつ清潔であることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。