Name: 生体のような器官型マウス網膜Wholemountの文化で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 25 min 26 s
Description: 学ぶマウス網膜のオルガノタイプホールマウント培養法とサイトスピン分析法。神経細胞間相互作用を保持した生理学的に近いモデルで、網膜の遺伝子機能研究や薬理学的操作に有用です。

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著者は、技術支援のための器官培養およびU. LaubとU.ゲルスターの設立と初期支援のためにE.デラロサとAI Valencianoに感謝します。

すべての機器および試薬は、滅菌購入する必要がありますまたは熱または蒸気滅菌または70％エタノールで滅菌する必要があります。 動物実験は動物実験で定められている実験的な手続きと規制のための動物の管理と使用に関するNI​​Hのガイドラインに従って、欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して行われたという著者らの状態ケアとデュースブルク - エッセン大学（ドイツ）での委員会（IACUC）を使用してください。 パート1：異なる発達段階のマウスの目の核出術胚の眼の摘出<ol><li>時間妊娠交配が設定され、膣栓が女性の交配で検出される日の朝は、妊娠0日を指定されます。 </li><li>とワックス基板6上に固定されて：胚の開発が必要な段階（日胚（E）15ここでの）に達したときに妊娠した女性は、頸椎脱臼により屠殺された。 </li><li>腹壁を正中線に沿って切断し、皮膚フラップはピン6で横方向に固定され、70％エタノールで湿らされています。 </li><li> uterussesは切り離さと冷PBS 6のビーカーに移し、腹部から削除されます。 </li><li>胚を分離し、ペトリ皿と子宮の壁に転送し、胚の膜を鉗子6の使用で慎重に除去されています。 </li><li>胚は、斬首によって殺される。 </li><li>眼は眼窩から目を"剥離"、罰金、湾曲鉗子の使用となる摘出されています。 </li></ol>出生後と大人の目の摘出<ol start="1" type="1"><li>若い仔は、頚椎脱臼により斬首、古い子犬や大人に殺されている。 </li><li>最大出生後の段階P15に、マウスは、彼らの目を開く時のポイント、目のスリットは、機械的に鉗子を使用して開かれ、春のはさみとまぶたの二つ横カットを拡大する必要があります。 </li><li>目が軌道に圧力をかけて、湾曲鉗子の助けによって摘出されています。 </li></ol>注：、軌道の骨はまだ軟骨な生後2日目の時点で、それは目を削除しようとしたときに過剰な圧力を適用しないことが重要である。 これとは対照的に、成体マウスでは、軌道骨は会社です。このように、目を摘出するためには、事前に目のスリットを大きくすることなく軌道への圧力を適用するのに十分です。 パート2：胚、生後および成体マウスの網膜の解剖網膜の解剖<ol><li>目は、滅菌PBSと周囲の目の層を持つ小型のペトリ皿に置かれている解剖顕微鏡下で除去されています。 </li><li>外側の目のレイヤーを削除するには、出生後の段階と大人の目には視神経はできるだけ基礎の近くに鉗子で春のハサミやピンチオフの助けによって切断する必要があります。 </li><li>視神経が最初に格納されていた穴の裏面が手前になるように、目を回す。視神経が目の層を貫通サイトから2つの非常に微細な鉗子の先端と網膜と色素上皮の間に網膜下腔を入力してください。 注：通常、色素上皮が容易にその暗い色によって識別することができます。一部のマウス変異株では - 特にアルビノの動物で - この色素層はしかし、着色ができない場合がありますので、容易に検出することがあります。 </li><li>慎重に、両方の鉗子でいずれかの側に切断すると、添付脈絡膜と強膜と色素上皮を削除します。 </li><li>他の鉗子で、残りの網膜のカップを保持しながら、アップ角膜のレベルまでの層を剥がし、その後、レンズ側にアイカップをオンにし、色素上皮、脈絡膜と強膜と一緒に角膜を削除します。 </li><li>小さなレンズと一緒に硝子体をつかみ、ピンセットで涙ながら、第二鉗子と場所で網膜wholemountを保つ。 注：胚の目を解剖すると、完全に硝子体と一緒に硝子体の下三角、テントのような毛細血管叢を除去することを確認してください。 大人の目では、硝子体は、側面で把握する必要があるとケアは、その内容がその削除を妨げ、鉗子の粘性とムチそのまま鉗子の先端ではなくピアス硝子体に取られる必要があります。 </li><li>器官wholemount文化のために網膜のカップは、200μlのダルベッコ改変イーグル培地（下記参照）を含む96ウェルプレートに収集されます。 </li></ol>注：個々の網膜の解剖の間に、培地のpHは炭酸系を介してCO 2によってトリガされるようにインキュベーター中の培地を含む96ウェルコレクションプレートを維持する。 パート3：マウス器官網膜wholemount文化<ol><li>重み7.8グラムダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F - 12 HAM（DMEM）と0.6グラムのNaHCO 3とMiIliQ水の両方を溶解して500mlの文化を準備します。 7.15にpHを調整する。ボンネットの下、および2.5ミリリットルgentamicine（200 mM）を、50μlの亜セレン酸ナトリウム（株式：：52μg/ml）、プロゲステロン（60μg/ml株式）：50mgのアポtransferin、50μlのputrescin（60mg/mlストック）を追加します。ボトルトップフィルタを介して混在させるとフィルタ。使い方は、ml培養液あたり10μlをグルタミン（200mMの）を追加する直前。 注：インスリンが効果を打ち消すので、これ血清およびインスリンを含まない培地は2週間までに4℃で保存し、アポトーシス誘導の実験に使用することができます。 24時間よりも長いためwholemountsのインキュベーションが望まれると細胞死の率が評価されない場合、血清インスリン（例えばウシ胎児血清、FCS）やサプリメントは、生存率を改善するために追加する必要があります。 </li><li>文化を開始する前に、網膜wholemountsは37℃で15分間プレインキュベートされている-10 M llerのグリア細胞の内側と外側の境界膜を含むヒアルロニダーゼを事前に消化するために0.5mg/mlヒアルロニダーゼを含む200μlの暖かい、pHのバランスDMEMとCセル、外生的に適用される物質の促進浸透。 </li><li>網膜は、2ミリリットル化学的に定義されたダルベッコ改変イーグル培地中の可能性や器官wholemountsとして培養と同様にいくつかのヒアルロニダーゼで24穴プレートに転送されます。 注：網膜を転送するには、1ミリリットルピペットを使用し、開口部を広げるためにピペットの先端を数ミリを切る。胚の眼の場合は、200μlのピペットチップで十分です。刃第二ピペットチップの挿入やねじれによって平滑化されるべきである。 24〜48時間の短期培養のため、すべての手順がベンチで行うことができますが、文化の汚染が問題であることが判明した場合、一つはフードの下で動作するはずです。 </li><li> 37 5％CO 2雰囲気における° Cで48時間、組換えの要因と薬理学的処理を施して例えば-の文化は24のために維持されます。 </li></ol>第4部：培養網膜wholemountsの解離<ol><li>希望の培養時間の後、網膜を850μlのPBSと50μlのウシ血清アルブミン（、30 mg / mlのBSA）を含む丸底で2ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに回収されています。 </li><li> 37℃まで加熱加熱ブロック、℃に網膜をエッペンドルフチュー​​ブをセット</li><li>各エッペンドルフチュー​​ブに25μlのコラゲナーゼ（200 U / ml）および25μlのヒアルロニダーゼ（20mg/ml）を追加し、シリコナイズパスツールピペットを介して3つのパスで単一の細胞懸濁液中に網膜を解離開始。 </li><li> 10μlのトリプシン（1mg/ml）を追加し、3〜5分間待ってから、徐々に機械的に組織を解離するためにシリコン処理パスツールピペットで上下に3-5回ピペッティング。 </li><li> 10μlのDNase Iを（5mg/ml）を追加し、もう一度ゆっくりシリコナイズパスツールピペットで上下に3-5回ピペッティング、3〜5分間待ちます。 注：酵素的解離のためのインキュベーション時間は様々で、それぞれ、目の大きさや発達段階に依存します。優しく上下にピペッティングして組織の酵素消化の段階を確認してください。 </li><li>細胞懸濁液は今では均質ではないが、依然として大​​きな細胞凝集体が含まれている場合は、追加の10μlのトリプシンおよび10μlのDNase Iを加える</li><li>細胞懸濁液が均質である場合、組織の消化が10μlのEDTA（0.5 M）の添加により停止されている、エッペンドルフチュー​​ブをヒーターから削除され、細胞懸濁液1ミリリットル新鮮な、氷冷8％パラホルムアルデヒドを添加することによって1時間は固定されている（PFA）回転シェーカー上で室温で。 </li></ol>パート5：解離細胞懸濁液の洗浄<ol><li>細胞懸濁液は、° Cと0.2 rcfで冷却遠心機で4℃で5分間遠心分離されています。 </li><li>上清を捨て、ペレットを1ミリ​​リットルを含むPBS 3mg/ml BSAに再懸濁されている。 </li><li>回これらの洗浄工程を繰り返した後、ペレットを最終的に3mg/ml BSA、5mMのEDTAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含む500μlのPBSに再懸濁されている。 </li></ol>注：ナトリウムの酸の添加は、4で数日間℃で細胞懸濁液の貯蔵を可能にするしかし、免疫細胞化学的染色が続く場合、染色質の損失でこの結果として、再懸濁バッファーにナトリウムの酸を追加しないでください。 パート6：定量的なアポトーシスと増殖の解析のための細胞懸濁液のサイトスピン<ol><li> 1つまたは2つの穴とサイトスピン漏斗付きつや消しエンドの顕微鏡スライド、サイトスピンフィルタがサイトスピンスライドクリップに挿入されます。スライドクリップが閉じられ、サイトスピンのローターに配置される。 </li><li>解離細胞懸濁液を穏やかにピペッティングでホモジナイズする。 注：網膜の発達段階に応じて、解離の手順から細胞懸濁液が必要になる場合があります細胞の可算数を取得するためにPBSで希釈する。 </li><li>細胞懸濁液のアリコート（100μl）をサイトスピン漏斗に適用されます。 注：漏斗に細胞懸濁液をピペッティングする際、ピペットの先端は漏斗の底にすべての方法を下に到達する必要があります。これはサイトスピンした後、セルスポットに見えるように空気の泡を、作成し、細胞数を妨げるようピペットの第2の圧力ポイントを介してプッシュすることが重要です。 </li><li>細胞懸濁液は、7分間、700 rpmでスライド上にスポットされています。 </li><li>蛍光マウンティング培地でマウントされて、、アポトーシスレベルの外因的に適用される要因の効果の判定のために細胞を4'、6 - ジアミジノ-2 - フェニル（2μg/mlDAPI）で染色することができます。細胞のアポトーシスの変化は、サイトスピン細胞のスポットで、少なくとも1000個の細胞を（少なくとも10 pycnotic核を含む）カウントし、細胞の死亡率は全細胞の割合として計算される3,4を数えることによって決定することができます。 注 ：別の方法として、アポトーシス核の分布はTDT -媒介dUTPニック末端標識（TUNEL）により培養網膜wholemountsのflatmounts 3またはクライオスタットsections4で評価することができます。 </li><li>文化とBrdUの取り込みの終了は、抗BrdU抗体（例えば、発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ州、米国）を用いて免疫組織化学的染色により、細胞ホモジネートのcytospinsで視覚化する前に細胞増殖の検出のために、BrdUは（5μM）6H追加することができます。 </li><li>異なる網膜細胞型に対する治療の効果はBrn3a（神経節細胞のマーカー）またはオプシン（視細胞マーカー）およびDAPIで対比染色のようなニューロンに特異的な抗体によってcytospinsで可視化することができる。 </li></ol>パート7：代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：マウスの器官型網膜wholemountsの準備のステップ と両眼を持つマウスの頭部。アップレンズ面とBネズミ目、まだ場所ですべてのレイヤー。視神経と裏面からCマウスの目はまだ接続されている。強膜と色素上皮部分的に削除されたとDネズミの目が。Eマウス網膜角膜、強膜と色素上皮は完全に削除されますが、まだ場所でのレンズと硝子体は、レンズと硝子体とFマウス網膜wholemountカップ除去。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：サイトスピンやセクションによって器官網膜wholemount文化の分析 アポトーシスの分析については、解離細胞懸濁液のcytospinsはDAPIとpycnotic核で染色される核の断片化やクロマチンの凝縮（の矢印 ）で区別することができます。また、wholemountセクション（CE;マウス網膜生後（P）2）や網膜flatmount（F）は、TUNELアッセイに供し、DAPI（E）で対比染色することができます。異なる網膜細胞型に対する治療の効果は、神経節細胞マーカーBrn3a（Bの矢印 ）のようなニューロンに特異的な抗体によってcytospinsで可視化することができるGCL、神経節細胞層;。INL、将来の内顆粒層。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

<ol><li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free%2C+bioreactor-based+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li>
<li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li>
<li>de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li>
<li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+How+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
</ol>

解離、単分子層以上のマウス器官網膜wholemount文化2-5、retinospheroidまたは再集計された3D回転楕円体の培養神経細胞の相互作用との接続の保全1嘘、の利点は 、in vivo の状況で模倣した。旧レポート2〜比較して、私たちのビデオの記事では、網膜を損傷することなく、マウスの目とレンズと硝子体の除去を含む、さまざまな発育段階の網膜の解剖摘出における特異性の詳細なデモンストレーションを提供します。両方の網膜の層への物質のアクセスを妨げるようにレンズと硝子体の除去は、薬理学的操作のために不可欠です。他の報告されたマウス移植片培養システムとは対照的に、我々はさらに、外生的に適用される物質を3〜5のアクセシビリティを促進する、網膜wholemountカップフリーフローティングを私たちの器官培養のために支持材料、例えばポリカーボネート膜2を 、使用しますが、文化はありません。 インシュリンなしで化学的に定義さ...

<table ><tbody ><tr ><td >マウス</td ><td >動物</td ><td >Charles River Laboratories</td ><td ></td ><td ></td ></tr><tr ><td >解剖顕微鏡</td ><td >器具</td ><td >Carl Zeiss, Inc.</td ><td ></td ><td ></td ></tr><tr ><td >PBS</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td ></td ><td >PBSは冷却（&amp;gt; 4&amp;#x00B0;C）され、滅菌されている必要がある</td ></tr><tr ><td >ダルベッコ改変イーグル培地 / 栄養混合液 F-12 Ham</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >D 8900</td ><td >DMEM / F-12</td ></tr><tr ><td >アポトランスフェリン</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >T 1147</td ><td ></td ></tr><tr ><td >プトレシン</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >P 5780</td ><td ></td ></tr><tr ><td >亜セレン酸ナトリウム</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >S 9133</td ><td ></td ></tr><tr ><td >プロゲステロン</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >P 6149</td ><td ></td ></tr><tr ><td >ジェンタマイシン</td ><td >試薬</td ><td >Invitrogen</td ><td ></td ><td ></td ></tr><tr ><td >L-グルタミン</td ><td >試薬</td ><td >Invitrogen</td ><td >25030-024</td ><td >200 mM (100X)、液体</td ></tr><tr ><td >ウシ血清アルブミン (BSA)</td ><td >試薬</td ><td >Carl Roth Gmbh</td ><td >8076.3</td ><td >30 mg/ml</td ></tr><tr ><td >コラゲナーゼ</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >C 0773</td ><td >200 U/ml</td ></tr><tr ><td >トリプシン</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >T4799</td ><td >ブタ膵臓由来; 1 mg/ml</td ></tr><tr ><td >ヒアルロニダーゼ</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >H 3884</td ><td >200 mg/ml</td ></tr><tr ><td >DNase I</td ><td >試薬</td ><td >Roche Group</td ><td >1 284 932</td ><td >10 mg/ml</td ></tr><tr ><td >EDTA</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >E 6511</td ><td ></td ></tr><tr ><td >シリコン溶液</td ><td >試薬</td ><td >SERVA Electrophoresis</td ><td >35130</td ><td ></td ></tr><tr ><td >パラホルムアルデヒド (PFA)</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >P6148</td ><td >0.1M リン酸緩衝液 (pH 7.4) 中の 8% PFA</td ></tr><tr ><td >4&amp;rsquo;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール 二塩酸塩</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >D 0542</td ><td >DAPI</td ></tr><tr ><td >蛍光封入剤</td ><td >試薬</td ><td >Dako</td ><td >S3023</td ><td ></td ></tr><tr ><td >BrDU</td ><td >試薬</td ><td >Sigma-Aldrich</td ><td >B 9285</td ><td ></td ></tr><tr ><td >96ウェルプレート</td ><td >器具</td ><td >Falcon BD</td ><td >3072</td ><td ></td ></tr><tr ><td >24ウェルプレート</td ><td >器具</td ><td >Falcon BD</td ><td >3047</td ><td ></td ></tr><tr ><td >パステールピペット</td ><td >器具</td ><td >Brand GmbH</td ><td >747720</td ><td ></td ></tr><tr ><td >ピンセット DUMONT #5</td ><td >器具</td ><td >Fine Science Tools</td ><td >11252-30</td ><td >極細の面取りシャンク (チップ 0.05 mm x 0.02 mm)</td ></tr><tr ><td >ピンセット DUMONT #7</td ><td >器具</td ><td >Fine Science Tools</td ><td >11271-30</td ><td >曲がりシャンク (チップ 0.07 mm x 0.10 mm)</td ></tr><tr ><td >スプリングシザー、直線、8cm</td ><td >器具</td ><td >Fine Science Tools</td ><td >15000-00</td ><td >細身の小型直線刃</td ></tr><tr ><td >標準シザー、直線、鋭縁/鈍縁</td ><td >器具</td ><td >Fine Science Tools</td ><td >14007-14</td ><td >斬首または頸椎脱臼に使用</td ></tr><tr ><td >エッペンドルフチューブ</td ><td >器具</td ><td >Eppendorf</td ><td ></td ><td >2ml; 遠心分離/サイトスピン中のペレットの沈殿を向上させるための丸底</td ></tr><tr ><td >冷却遠心機</td ><td >器具</td ><td >Eppendorf</td ><td ></td ><td ></td ></tr><tr ><td >回転振盪機</td ><td >器具</td ><td >CAT</td ><td ></td ><td ></td ></tr><tr ><td >サイトスピン</td ><td >器具</td ><td >Thermo Fisher Scientific, Inc.</td ><td ></td ><td ></td ></tr></tbody></table>

生体のような器官型マウス網膜wholemountの文化で

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

動物モデルの遺伝子と分析の対象とアブレーションは、入学する特定の網膜遺伝子機能のための古典的な戦略です。しかしながら、トランスジェニックは、網膜特異的またはコンディショナルノックアウトマウスモデルは、しばしば早期致死を表示したり、胎児や出生後早期の段階を超えて解析を防止する、深刻な奇形に苦しんでいます。 初代培養細胞は、外因的に適用される組換え因子、制御された環境での遺伝子やsiRNAによる遺伝子ノックダウンの過剰発現の影響を調べるための代替です。解離細胞の培養は、それによって薬理学的操作の後に外生的にトリガーの効果の識別を容易に、標的細胞に到達する内因性信号が低下するという利点があります。しかし、重要な細胞間相互作用は、最初に再集計されたretinospheroid文化1が使用されている場合でも、酵素消化または機械的な解離によって破壊されています。 これとは対照的に、器官型網膜wholemount文化が神経細胞の相互作用との接続はまだ保持さ2〜5で生体状況に近い生理的にシステムを提供しています。 このビデオの記事では、胚、生後および成体マウスの目の解剖の特殊性と神経の分析のため（2）解離とサイトスピン手順を含む器官網膜wholemountの文化のようなin vivoでの（1）設立のステップのデモンストレーションでステップを提供するアポトーシスと外因的に適用される組換え因子の存在下で培養した後、例えば器官wholemountsにおける網膜細胞の増殖、。

このビデオの記事では、器官型網膜wholemount文化や外因性誘導効果の分析のためのサイトスピン手順の確立を示しています。器官型網膜wholemount文化模倣体<em&gt; in vivoで</em&gt;状況と古典的なマウスの動物モデルの欠点を回避しながら大幅に実験操作のためのマウス網膜のアクセシビリティを促進する。

生体のような器官型マウス網膜Wholemountの文化で

特定の網膜遺伝子の機能を解明するための古典的な戦略は、遺伝子の標的アブレーションおよび動物モデルの解析である。しかし、トランスジェニックなどの...

こんにちは、ニコル・ダンカです。ドイツのD book ASIN大学解剖学研究所、神経科学部門の責任者を務めております。こんにちは、私は神経解剖学部にあるダンカ教授の研究室の博士課程学生です。本日は、器官培養網膜として、in vivoの状況に近い状態で神経網膜を培養するための便利なシステムをご紹介します。それでは始めていきましょう。遺伝子の標的アブレーションおよび動物モデルの解析は、特定の網膜遺伝子の機能を解明するための古典的な戦略です。しかしながら、トランスジェニックマウスモデルでは早期の致死性が認められたり、重度の奇形が生じたりすることが多く、胚期または生後早期以降の解析が困難な場合があります。一次細胞培養は、制御された環境下で外因的に投与したリコンビナント因子の影響を検討するための代替手法となります。解離細胞培養には、標的細胞に到達する内因性シグナルが低減されるため、外因的に誘導された効果の特定が容易になるという利点があります。しかしながら、細胞を分散させた培養では、重要な細胞間相互作用が消失してしまいます。対照的に、網膜の臓器様ホルモン培養は、神経細胞間の相互作用と接続が維持されており、生体内の生理的状況に近いシステムを提供します。本ビデオ記事では、水晶体および硝子体の除去を含む、マウス眼球の微小解剖の手順をステップバイステップで実演します。生後15日のマウスを断頭法により安楽死させます。細い曲がり鉗子を用いて、眼窩から眼球を剥離し、摘出します。生後2日の幼若マウスについても、出生後から断頭法により安楽死させます。マウスが開眼する15日目の時点では、分離個体をピンセットを用いて機械的に開眼させる必要があります。細い曲がりピンセットの先端を眼窩に挿入し、目の周囲の結合組織を除去します。生後2日目と同様に、眼窩骨はまだ軟骨状態で柔らかくなっています。眼球を取り出す際、ピンセットで強い圧力をかけすぎないことが重要です。生後15日のマウスパピーを頸椎脱臼により安楽死させます。その後、分離株を2回継代して増殖させ、スプリング剪刀で切断します。次に、弯曲鉗子を用いて眼窩に圧力を加え、眼球を摘出し、ペトリ皿に移します。成マウスは頚椎脱臼により安楽死させ、同様に弯曲鉗子で眼窩に圧力をかけることで、直接眼球を摘出できます。本セクションでは、異なる発達段階にあるマウスの眼球の特徴について説明します。小さなペトリ皿の中に、左から胚齢15日、生後2日、生後15日、および成体マウスの眼球が配置されています。滅菌PBSを用いて、解剖中に眼球の周囲層を除去しますが、その際、両前腕をベンチトップに置いてください。手を安定させるため、レンズ側がペトリ皿の底を向くように眼球を回転させます。胚の眼球を解剖する場合、発達中の視神経が眼球から出る部位はしばしば結合組織で覆われており、非常に細いピンセットの先端で網膜と色素上皮の間の網膜下腔に進入するためのスペースを作るには、この組織を除去する必要があります。強膜と色素上皮はまだ非常に柔らかく、容易に除去できます。ただし、硝子体と共に、硝子体下にある三角形の毛細血管叢を完全に除去してください。この粘着性のある血管叢は、網膜に損傷を与えずに残りの網膜カップから個別に除去することが困難ですが、これを放置すると外因性に投与した物質が網膜層へ浸透するのを妨げます。生後2日目の薬理学的処置においては、眼球後方の視神経をピンセットで摘除する必要があります。強膜や色素上皮を含む周囲の眼球層はまだ柔らかく、容易に除去できます。ただし、網膜を損傷させないよう注意してください。視神経孔から網膜下腔に入る際、2本のピンセットで慎重に左右に引き裂くことで、色素上皮を脈絡膜および強膜とともに除去します。次にアイカップをレンズ側に向け、ピンセットでレンズと硝子体を把持します。そして、引き離しながら、もう一方のピンセットでアイカップを固定します。生後15日目では、核出時に視神経が眼球に付着したままであることが多く、ピンセットで根元に近い部分を挟んで切断する必要があります。強膜はすでに緊密になっており、そのため網膜下腔への進入が困難になります。視神経を除去した孔の部分では、強膜、脈絡膜、および色素上皮の剥離がP2のときよりも難しくなります。角膜のレベルまで各層を剥離し、その後、眼球カップを水晶体側に向け、角膜を色素上皮、脈絡膜、および強膜とともに除去します。もう一方のピンセットで残りの網膜カップを保持しながら、小レンズと共に硝子体を把握し、ピンセットで引き剥がします。その際、もう一方のピンセットで成体眼の網膜ホルモンマウントを固定し続けます。網膜下腔にアクセスするために切断する必要がある視神経は、出生後の段階に比べて格段に太くなっています。脈絡膜は極めて強固であり、ピンセットで網膜下腔に穿入することが解剖において非常に困難な工程となります。また、色色素上皮を現行の膜および強膜と共に引き剥がすことはより困難になり、より制御された力が必要となります。硝子体の除去は胚眼に比べてはるかに容易ですが、硝子体の側面を把持する必要があります。硝子体の中身がピンセットに付着し、除去の妨げとなるため、ピンセットの先端で硝子体を突き刺さないでください。培養を開始する前に、外因的に投与する物質の浸透を容易にするため、ヒアルロニダーゼを含む内境界膜およびグリア細胞の自己制限膜を部分的に消化させる必要があります。この目的のために、網膜組織を損傷なく転移させるため、0.5 mg/mL の hyaluronidase を含む pH 調節済み modified eagles medium 200 µL を 96 ウェルプレートの各ウェルにピペッティングしてください。1 mLピペットのチップの先端を数ミリメートル切り落として開口部を広げ、2本目のピペットチップを挿入して回転させることで切断面を滑らかにします。網膜ホルモンを96ウェル回収プレートから、高濃度のdaysを含む培地が入った96ウェルプレートに移し、37 °Cで15分間プレインキュベートします。その後、ホルモンを、2 mLの化学的に定義されたBECUs修飾Eagle培地を含む24ウェルプレートに移します。ウェルあたりの培地量。網膜ホルモン培養物をインキュベーターに戻し、37 °C、5% CO2雰囲気下で24〜48時間維持します。850 µLのPBSと50 µLのbovine serum albuminを、丸底の2 mLエッペンドルフチューブにピペットで分注します。一般的なコニカルチューブの代わりにラウンドボトムのエッペンドルフチューブを使用することで、遠心分離時の細胞の沈殿が改善され、より安定した細胞ペレットが得られました。目的の培養時間が経過した後、網膜ホムンクルスを24ウェルプレートから、PBSおよびウシ血清アルブミンを含む2 mLのエッペンドルフチューブに移します。網膜ホムンクルスを含むエッペンドルフチューブを37 °Cに加熱したヒートブロックに配置し、25 µLのコラゲナーゼと25 µLを添加します。各眼球キューブにヒアルロン酸を加え、シリコンコートしたパステールピペットを用いて3回分注し、網膜組織を単一細胞懸濁液に解離させます。10 µLのトリプシンを加え、細胞懸濁液を3〜5分間インキュベートします。酵素による解離のインキュベーション時間は、眼球のサイズおよび発生段階に応じて異なります。ピペッティングをゆっくりと繰り返し、組織の酵素消化の状態を確認します。数分後、さらに3～5分間インキュベートした後、10 µLのDNaseを添加します。さらにゆっくりとピペッティングを繰り返し、細胞懸濁液を均質化します。細胞懸濁液が均質になったら、10 µLのEDTAを添加して組織の消化を停止させ、Eppendorfチューブをヒーターから取り出します。各EOLチューブに氷冷した8%Perfomal Hydeを1 mL加え、ローテーションシェーカーを用いて室温で細胞懸濁液を固定します。1時間の固定後、細胞懸濁液をローテーションシェーカーから取り出し、冷却遠心機にセットします。細胞懸濁液を40 °C、0.2 ×gで5分間遠心分離し、その後、ペレット化した細胞懸濁液を遠心機から取り出します。SUP上清を廃棄し、ペレットを3 mg/mL BSAを含む1 mLのPBSで再懸濁します。これらの洗浄工程を2回繰り返した後、最終的にペレットを500 µLで再懸濁します。3 mg/mL BSA、5 mM EDTA、および0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSを使用します。免疫化学染色を行う場合は、Resus懸濁緩衝液にアジ化ナトリウムを添加しないでください。添加すると染色の質が低下します。フロスト端付き顕微鏡スライド、1つまたは2つの穴が開いたサイトシンフィルター、およびサイトシンクリップに挿入されたサイトシンファンネル列を用意し、スライドクリップを閉じます。ファンネルとサイトシンフィルターの穴が一致していることを確認してください。すべてのスライドクリップをサイトシンセンターに配置します。その後、ローターを用いて均質化した細胞懸濁液を、ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせます。細胞懸濁液100 µLをファネルに分注する際は、ピペットのチップをファネルの底まで到達させてください。ピペットの第2ストップまで押し込まないことが重要です。これによりセルスポットに気泡が生じると、細胞数のカウントに支障をきたすため、ローターに蓋をして遠心機にセットします。単一細胞懸濁液を700 RPMで7分間遠心分離します。その後、遠心機からローターを取り出し、蓋を開けます。サイドクリップを開き、ファンネルとスライドクリップを取り除きます。次に、スライドの裏面に印を付け、Sail spotをマークします。フィルターが装着されている状態でフィルターを取り除き、Sail spotのあるスライドに封入剤を用いてカバーガラスを被せます。あるいは、細胞スポットをBREUまたは神経特異的抗体を用いて免疫化学的に染色することも可能です。本手法により、神経細胞間の相互作用や接続が保持されており、生体内の生理的状況に近い培養システムを提供する器官培養網膜の利点を実証しました。この培養システムは、マウスの眼における操作へのアクセス性を大幅に向上させます。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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