のテロメアG -オーバーハング構造の検討トリパノソーマ

次の実験の全体的な目標は、テロメアGのオーバーハング構造を調べることです。トラップブルーシーセルで。ネイティブインゲルハイブリダイゼーションは、配列特異的なオリゴプローブを使用して、ネイティブ条件下でテロメアの一本鎖領域にハイブリダイズします。

この一本鎖領域はテロメアGオーバーハング領域であるため、ハイブリダイズオリゴプローブの量はその長さアダプターを表します。ライゲーションにより、テロメアGオーバーハングの終了配列は、固有のオリゴが標識されるときに決定できます。この方法は、ライゲーション媒介一次伸長アッセイのために、テロメアGオーバーハング構造の末端への配列特異的アダプターのライゲーションを含む。

ガイドオリゴは、染色体末端に結紮される前に、末端にラベル付けされ、肛門に固有オリゴ入りされます。ライゲーション後、T 4 DNAポリメラーゼを用いて一次伸長を行います。Gオーバーハングの長さは、生成物が実際のGオーバーハング(Nはアダプター内のガイドオリゴの長さを表す)よりもnから6ヌクレオチドを引いたものであるため、決定できます。

こんにちは、私はクリーブランド州立大学の生物学、地質学、環境科学部の助教授であるbi Boです。ねぇ、ジオです。私はLee博士の研究室の大学院生ですが、今日はジオハンク構造を解析する手順をお見せします。

この手順を使用して、放射能に取り組みながらトラパッソのテロメアの構造と機能を研究します。今回の実験と同様に、適切な安全対策を講じる必要があります。これを試みる前に、機関の環境衛生安全部門に相談する必要があります。

このビデオでは、これらの前駆体の一部はデモンストレーション目的でのみ欠落しています。それでは始めましょう。この手順のこの部分の原則は、ネイティブ条件下では、ラベルなしのテルCプローブがC-C-C-T-Aの4回の繰り返しで構成されているというものです。

オリゴは、一本鎖テロメアGオーバーハング領域にのみハイブリダイズできます。したがって、ハイブリダイゼーション強度はオーバーハングの長さに比例します。変性および中和後、同じプローブがテロメア領域全体にハイブリダイズできるようになります。

このハイブリダイゼーションの強度は、テロメアDNAの総量を表し、ローディング制御として使用されます。最終的なGオーバーハングレベルは、ネイティブハイブリダイゼーションシグナルを変性後に得られるシグナルで割ることによって計算できます。この手順は、過去のフィールドゲル電気泳動またはPFGEによる無傷の染色体の分離から始まり、これはゲノムDNAを機械的にせん断することを避けるためにアグロスプラグで調製する必要がありますこの最初の溶解低融点、またはLバッファー内のLMPアグロスを50°Cで暖かく保ち、その後、遠心分離によって2億Tブルーシー細胞を収穫します。

すり酸を取り出し、細胞ペレットをL緩衝液で最終濃度500万細胞/ミリリットルまで再懸濁します。細胞懸濁液を摂氏42度から50度の間で10分間インキュベートします。次に、1つの容量の1.6%LMPを1容量の細胞に加え、使い捨てプラグ金型の各ウェルに85マイクロリットルの細胞懸濁液をすばやく混合します。

プラグが固まったら、5ミリリットルのLバッファーと1%サルコセルを備えた15ミリリットルの円錐管に移します。プロテイナーゼKパウダーをひとつまみ加えます。よく混ぜ合わせ、摂氏50度で48時間インキュベートします。

インキュベーション後、緩衝液を廃棄し、プラグを5ミリリットルのL緩衝液で2回洗浄します。その後、LバッファーストロークSARカオールでプロテイナーゼK消化をさらに48時間繰り返します。プラグを新しいLバッファーで再度洗浄し、Lバッファーに摂氏4度で保管します。

これらのプラグは2週間以内に使用する必要があります。書面によるプロトコルに記載されているように、DNAプラグを使用してアグロスゲルを調製します。次に、ジェルをシェフDR2ユニットに流します。

PFGEに続いて、ゲルを染色し、染色写真を撮り、乾燥させます。ゲルが乾いたら、ゲルをハイブリダイゼーションバッグに入れ、20ミリリットルのプレハイブリダイゼーションバッファーを加えます。バッグからできるだけ多くの空気を取り除き、バッグを密封します。

ハイブリダイゼーションバッグを摂氏50度の水浴中で、ゲルラベルをプレハイブリダイズしながら、少なくとも1時間穏やかに揺さぶってインキュベートします。オリゴプローブは、反応を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、90マイクロリットルのTNESバッファーを反応混合物に加えます。

標識プローブを精製するには、既製のG 25カラムの上にプローブをロードします。700マイクロリットルのTNASバッファーで洗浄し、プローブを600マイクロリットルで溶出します。ゲルプレハイブリダイゼーションに続いて、標識プローブを5分間煮沸し、それを25ミリリットルの新鮮なプレハイブリダイゼーションバッファーに加える。

ハイブリダイゼーションバッファーを作るには、プレハイブリダイゼーションバッファーをバッグフィルターから取り出します。ハイブリダイゼーション混合物を0.22μmシリンジフィルターで滅菌し、ハイブリダイゼーションバッグに直接加えます。袋を密封し、ぬるま湯を入れた浅い容器に入れます。

容器全体を摂氏50度の水浴に入れ、穏やかに揺らしながら一晩インキュベートします。翌日、ハイブリダイゼーションバッグの小さな開口部を50ミリリットルの円錐管に切ります。ハイブリダイゼーション混合物をできるだけ多く注ぎます。

プローブをマイナス20°Cで凍結したままにします。ハイブリダイゼーションバッグからゲルを取り出し、容器に入れ、書面によるプロトコルに記載されているようにゲルを洗浄して乾燥させます。乾いたら、ジェルをラップで包み、リン酸化イメージャーに約3日間さらします。

3日後、リン酸化イメージャーをスキャンして、変性後のハイブリダイゼーションを行います。まず、ゲルを変性緩衝液中で室温で30分間インキュベートします。次に、ゲルと中和バッファーを30分間洗浄します。

次に、ゲルを蒸留水で3分間すすぎます。ゲルを摂氏55度で1時間プレハイブリダイズします。以前と同じハイブリダイゼーション混合物を含むプローブを使用してハイブリダイゼーションを繰り返しますが、ハイブリダイゼーション後一晩で摂氏55度で行います。

以前と同様にゲルを洗って乾かします。次に、ゲルを包み、リン酸化イメージャーに約2時間さらします。リン酸化イメージャーをスキャンする 最後に、変性前に得られたハイブリダイゼーションシグナルを変性後に得られたハイブリダイゼーションシグナルに正規化します。

この手順のこの部分では、T、単なる末端ヌクレオチドはアダプターライゲーションによって決定されます。このユニークなオリゴは、ガイドオリゴにアニールと標識された末端で、テロメア末端にライゲーションされます。独自のガイドアダプターが、末端テロメア配列と互換性のある3つのプライムオーバーハングを持つ場合にのみ、アダプターはライゲーションされます。

T・ブルーシーのために。テロメアは、TTの6つの異なるヌクレオチドのいずれかで終結することがあり、GGGが繰り返されます。したがって、このプロセスを開始するために6つの異なるガイドオリゴが使用されます。

ユニークなオリゴのマイクロリットルあたり10モルの6マイクロリットルを、10倍のPNKバッファーの3マイクロリットル、5マイクロリットルのガンマP 32 A TP、14マイクロリットルの二重蒸留水、および2マイクロリットルのTフォーPNKと混合することにより、ユニークなオリゴをキナーゼで処理します。混合物を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、カヤッククイックヌクレオチド除去キットを使用して、取り込まれていないホットA TPを除去して溶出させます。

端部は60マイクロリットルの溶出バッファーでオリゴを標識しました。マイクロリットルあたり約1Pモルの最終濃度を得るためには、ガイドオリゴに独自のオリゴをひざまずかせてアダプターを作成します。精製した独自のオリゴ10マイクロリットルを、各ガイドオリゴ2マイクロリットルとニーリングバッファー1マイクロリットルに加えます。

チューブを摂氏85度のヒートブロックに入れ、ヒートブロックの電源を切ります。チューブとヒートブロックをRI温度まで数時間冷まします。次に、アダプターを全ゲノムDNAにライゲーションします。

混合物を摂氏16度でPCR装置で一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、書面によるプロトコルに記載されているように、制限エンドヌクレアーゼ消化を行います。各サンプルに10倍のオレンジ色のG染料を3マイクロリットル加えます。

DNAサンプルを20 x 20 cmの0.7%agrosゲルにロードします。ゲルを30ボルトで30分間泳がせます。次に、電圧を120ボルト未満に保ち、1時間で合計1000ボルトになるように、より高い電圧で続行します。

ゲルが泳いだら、typhoonスキャナーでAUMブロマイドステインゲルをスキャンします。最後に、アグロスゲルを乾燥させ、乾燥させたゲルをリン酸化イメージャーに一晩さらします。ライゲーション媒介プライマー伸長では、ガイドオリゴは末端標識され、染色体末端のみにライゲーションされる前に、固有のオリゴにアニールされます。

Gオーバーハングと互換性のある3プライムオーバーハングを持つ独自のガイドアダプターがライゲーションされます。非ライゲーションオリゴペアを除去した後、一次伸長は、鎖置換を欠き、5プライムから3プライムのエンドヌクレアーゼ活性を欠くT4 DNAポリメラーゼを用いて実施できます。したがって、拡張ガイドオリゴの最終的な長さは、Gオーバーハングの長さを反映しています。

ライゲーションを介したプライマー伸長キナーゼを開始するには、ユニークなオリゴを処理し、ガイドオリゴを両方の混合物を摂氏37度で60分間インキュベートします。1.5ミリリットルのeinor tubesに10マイクロリットルのリン酸化、ユニークなオリゴと10マイクロリットルの標識されたガイドオリゴを結合することにより、ガイドオリゴとユニークなオリゴをAneel、オリゴをAnilし、Anilガイドをライゲーションします。前述のようにテロメア末端へのユニークなオリゴアダプターは、DNAを沈殿させ、書かれたプロトコルに記載されているように一次伸長を行います。

10%アクリルアミド、7モル尿素1倍TPEゲルを調製し、エクステンション製品を走らせるための。事前に煮沸した各サンプルに4マイクロリットルを、色素を加えたゲルにロードします。青色の染料がゲルの底に達するまで、1回のTBEで800ボルトでゲルを泳がせます。

その後、ガラスプレートからゲルを取り出します。ゲルドライヤーを摂氏65度に30分間保持するように設定し、ゲルドライヤーが室温に戻った後、ゲルをさらに30分間乾燥させ、最終的にリン酸化イメージャーに2時間さらします。PFGEによって分離された無傷のtbrc染色体が示されています。

Tブルーシー細胞には通常、約100個のミニ染色体が含まれており、すべて同じサイズのゲル上の同じ位置に移動します。この事実により、TCオリゴプローブとのハイブリダイゼーション後、テロメアGオーバーハングシグナルはミニ染色体上で最も顕著になります。変性および中和後、TLCオリゴプローブによるハイブリダイゼーションにより、すべての染色体末端にテロメアシグナルが明らかになります。

TLGオリゴプローブによるハイブリダイゼーションは、Tブルーシー細胞がテロメアCオーバーハング構造を持たないため、通常、ハイブリダイゼーションシグナルを生じさせません。変性および中和後、Tel Gオリゴプローブとのハイブリダイゼーションにより、すべての染色体末端にテロメアシグナルが明らかになります。各レーンに等量のDNAをロードすることは、アダプターライゲーションアッセイによるテロメア末端ヌクレオチドの決定に不可欠であり、これは、このプロトコルにおけるゲルの臭化ジウム染色によって示され、標識された末端はユニークなオリゴおよびガイドオリゴアダプターは、テロメアgオーバーハング配列を持つ染色体末端にのみライゲーションされ、ガイドオリゴに適合します。

ユニークなオリゴは末端標識されているため、ライゲーション産物は放射性であり、強いシグナルを発します。レーン1は、大量のユニークなTGワンアダプターがテロメア末端に連結されたことを示す強い信号を発する。TG oneはC-C-C-T-Aの終端配列を持つため、テロメアgのオーバーハングはこのアダプターに連結され、TT A GGG.

他のガイドオリゴを使用したライゲーション産物の有意な量は観察されず、TT A GGGで終わるテロメアがTブルーシー細胞で優勢であることを示しています。標識されたガイドオリゴを末端にロードすると、ネガティブコントロールおよびライゲーションなしのサイズマーカーとして機能します。標識されたガイドオリゴの端部の長さは22ヌクレオチドです。

約44ヌクレオチドのバンドは、染色体末端へのライゲーション後の残留非変性アダプターである可能性が最も高いです。延長製品のサイズは、Gオーバーハング構造の長さを反映しています。ほとんどのTブルーシーテロメアGオーバーハングはTTアGGGで終わります。

しかし、これらのGオーバーハングは約10ヌクレオチドと非常に短いようです。ライゲーションTGから延長された生成物として、1つのガイドオリゴはガイドオリゴ自体よりもそれほど長くはありませんが、テロメア末端にライゲーションされたTGフォーアダプターは少量ですが、ライゲーションされたTGフォーから延長された生成物ははるかに長く、最長の生成物は約55ヌクレオチドです。したがって、tbrc細胞では2種類のテロメアGオーバーハング構造が観察されました。

ライゲーションが実際にテロメアGオーバーハング構造に起因する場合、ゲノムDNAをXO oneまたはXOT(これらは3つの主要なオーバーハング特異的ヌクレアーゼ)で処理すると、ライゲーション産物が失われるはずです。どちらのタイプのGオーバーハング構造も、このような処理に敏感です。トラパッソ・ブルのテロメア・ジャン構造を解析する方法を紹介しました。

この手順を実行するときは、各レーンに同量のサンプルをロードすることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。