哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

このビデオプロトコールで実証されているのは、哺乳類細胞株におけるNHEJまたはHRによるDNA二本鎖ブレーキ修復の効率と精度を測定する方法です。この手順は、NHEJまたはHRレポーターカセットの染色体に統合された単一コピーを含む細胞株を生成することから始まります。次に、これらのレポーター細胞に、1つの発現プラスミドとDS redを発現するI SCEと1つのプラスミドの混合物をトランスフェクションします。

私はsce。1つのエンドヌクレアーゼはレポーターコンストラクトで二本鎖切断を生じ、DS REDはトランスフェクションコントロールとして機能します。次に、GFP陽性細胞とDS赤色陽性細胞の割合をファックスで分析し、必要に応じてNHEJまたはHRの効率を定量化します。

修復の忠実度は、大腸菌のレポーター製品を救出し、修復製品の配列を決定することによって分析されます。このように、特定の細胞株におけるダブレット鎖切断またはDSB修復の効率と忠実度は、修復イベントのフローサイトメトリー定量と修復産物のシーケンシングに基づいて決定されます。この方法には、ダブルストリングブレーキ修理の解析のための既存の方法に比べて多くの利点があります。

まず第一に、この方法は、相同組換えと非相同および結合とを具体的に区別します。次に、この方法は高度に定量的であり、フローサイトメトリーによる数百万の細胞の分析を可能にし、その後、この方法は、修復が完了した後に抗生物質耐性clsを選択するための細胞の広範なパッケージングを必要としません。そして最後に、グリーンセルの外観を見ることで、修復の完了をリアルタイムで監視できます。

また、この方法は、ウイルス変異細胞タイプのHRやHEGA修復効率の測定や薬物治療後の修復効率など、修復分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。細胞周期のさまざまな段階でA修復を調べ、修復率を測定する 非常に一般的です。一般に、この方法に不慣れな個人は、良好なトランスフェクション効率を達成することが重要であるため、苦労するでしょう。

この手順では。2つのレポーターカセットを使用して、二本鎖DNA切断の修復をアッセイします。1つのカセットは、非相同端部接合またはN-H-E-J-D-N-A修復の検査に使用されます。

もう一つは、相同組換えやHR DNAが非相同末端を修復するのを見るために使用されます。ジョインレポーターカセットには、PEM one遺伝子またはGFP PEM one遺伝子から3キロベースイントロンが操作されたGFP遺伝子が含まれています。要するに、P oneイントロには、二本鎖切断を誘導するためのヒンディー語3およびI SCE oneエンドヌクレアーゼの認識配列が隣接するアデノウイルスエクソンが含まれています。

I SCE 1 サイトは逆向きであり、SCE 1 は非回文認識シーケンスを持つため、2 つの反転サイトは互換性がなくなります。DNAは互換性がありません。DNAは、天然に存在するdssを最もよく模倣します。

未配置のNAEJカセットは、アデノウイルスエクソンがG-F-P-O-R-Fを破壊するため、GFP陰性です。ISEEによる二本鎖DNA切断の誘導により、アデノウイルスエクソンが除去され、NHEJはGFP遺伝子の機能を回復させます。相同組換えレポーターカセットも、HRカセット内のGFP PEM oneコンストラクトに基づいています。

G FP PEM oneの最初のエクソンには、22塩基対の欠失と3つの制限部位の挿入が組み合わされています。I SCE 1 ヒンディー語 3 I SCE E 1.この削除により、ここでもNHEJイベントによってGFPを再構成できなくなります。

I SCE One サイトは逆向きです。そのため、I SCE 1 の消化は互換性のない端を残します。GFP PMM 1の最初のコピーの後には、プロモーターからTGを差し引いたもの、GFP M1の第一エクソンとtイントロが続きます。無傷のコンストラクトは、I sce E 1 回の消化による二本鎖切断の誘導時に GFP 陰性です。

機能的GFP遺伝子は、第1のGFP PMMの2つの変異コピー間の遺伝子変換イベント、1つのエクソン、一本鎖膝跳ね越えなどの他のタイプのDSB修復によって再構成される。また、NHEJはGFP遺伝子を再構成しません。GFP遺伝子の2番目のコピーが不足しているため。

第1のA TGコドンと交差または一本鎖の膝打ちによる第2のエクソンの解像は、GFP活性を回復させません。したがって、この設計により、哺乳類細胞の主要なHR経路である遺伝子変換による分解能の排他的な検出が可能になります。この手順を開始するには、狂言のエンドフリーキットを使用して、NHEJまたはHRレポータープラスミドの高品質ストックを調製し、プラスミドを10マイクログラム直鎖化し、消化液からDNAを精製します。

プラスミド調製の詳細については、添付の書面によるプロトコルを参照してください。.トランスフェクションの準備中。正常なヒト線維芽細胞が最良の成長条件下で維持されていることを確認してください。

凍結バイアルから開始する場合は、トランスフェクション前に細胞を2回分割します。コンフルエンスのプレートから開始すると、細胞は一度分裂し、細胞は70〜80%のコンフルエンスに成長します。これは、100mmプレートに5倍10〜5番目の細胞を播種すると約2日かかります。

トランスフェクション効率を最大限に高めるには、細胞を対数増殖させます。活発に増殖している培養物は、2枚の100mmプレートから6個の細胞のうち約2倍をトランスフェクション採取するために表面に付着した丸みを帯びた細胞として見られるMステージの細胞を含む。細胞がプレートから80%離れるとすぐにトリプシンを止める細胞をトリプシンに過度にしないことが重要です。

NHDF溶液に細胞を再懸濁します。細胞はNHDF溶液に感受性があるため、インキュベーション時間を最小限に抑え、細胞を穏やかに混合します。次に、amaxa nucleoエフェクターを使用して、正常なヒト線維芽細胞用の0.5マイクログラムの直鎖状レポーターコンストラクトを細胞にトランスフェクションします。

これらのトランスフェクション条件は、トランスフェクションの大部分において、遺伝子またはG418の1ミリグラム当たり1ミリグラムでトランスフェクション後24時間で積分するレポーターコンストラクトの単一コピーの統合をもたらす。染色体に統合されたレポーターコンストラクトを持つ細胞を選択するには、7〜10日間選択を続け、その後、個々のG 4 1 8耐性コロニーを選択するか、耐性クローンをプールします。培養物を100mmプレート約5枚に拡大

将来の使用のために3つのプレートを凍結し、残りの2つのプレートを100ミリメートルプレートあたり5番目のセルの10の5倍に拡大します。通常、100mmプレート10枚あれば、トランスフェクション5枚分に十分です。レポーターコンストラクトを含む細胞が70〜80%に達したとき、5マイクログラムのI sce 1発現プラスミドと0.1マイクログラムのDSレッドプラスミドの混合物とのコンフルエンス。

トランスフェクション効率制御として、AM maxonヌクレオエフェクターを使用して、対数的に増殖する培養物から6つの細胞のうち約2×10をトランスフェクションします。DSP効率はGFP陽性細胞とDS赤色陽性細胞の比で測定されるため、ISCE oneとDS赤色プラスミドの混合物の変動が結果に影響を与える可能性があります。プラスミドの品質も、トランスフェクション効率を変化させることにより結果に影響を与える可能性があります。

したがって、一貫した測定を得るためには、1つの実験内で同じプラスミドミックスを使用することが重要です。同時に、各コントロールのファクトに対して3つのキャリブレーションコントロールを準備します。6つの細胞のうち10の約2倍をトランスフェクションします。3つのコントロールは、5マイクログラムのEGFP発現プラスミド、5マイクログラムのDS、赤色プラスミド、および5マイクログラムです。

蛍光タンパク質を発現しないコントロールプラスミドです。トランスフェクションの3日後、GFPおよびDS検出用フィルター付き蛍光倒立顕微鏡により、GFPおよびDS赤色タンパク質のトランスフェクションおよび発現の効率を確認します。赤は、ファックス分析の前にさらに1日間細胞を増殖させ、トランスフェクションの4日後にI SCE 1トランスフェクション細胞とコントロール細胞を収穫します。この段階では、すべての細胞を採取し、丸い形の細胞を持つことが重要です。

これを達成するには、トリプシンの化時間を長くするか、トリプシンの濃度を高くします。顕微鏡で細胞を検査し、細胞の99%がプレートから分離し、丸い形をしていることを確認します。細胞を500マイクロリットルのPBSに懸濁し、ファックス管に移します。

細胞を氷上に保ち、光から保護しますが、細胞を氷上に数時間保存することができます。最良の結果を得るには、回収後すぐに細胞を分析してください。次に、TFP DS RED とネガティブコントロールを使用してファクトをキャリブレーションします。

電圧と色補正を調整して、すべての蛍光セルを分析に含めるようにします。実験サンプルの蛍光強度は、コントロールの蛍光強度よりも低いことに注意してください。コントロールで事実を較正した後、I SCE 1トランスフェクション細胞を分析し、GFPとdsとの間の潜在的な干渉を防ぐために、各治療で少なくとも20,000個の細胞を数えます。

赤色蛍光は、GFP陽性細胞またはDS赤色陽性細胞の割合を25%未満に保ちます割合が高い場合は、DS REDまたはI sce E one plusidの量を減らします。GFP陽性細胞の割合はD-N-A-D-S-P修復の効率に対応し、DS赤色陽性細胞の割合はトランスフェクションの効率を示します。D-N-A-D-S-P修復の相対効率を、GFP陽性細胞とDS赤色陽性細胞の比率として計算します。

修復された差止命令の精度を決定するために、eco R one酵素の環状化とコンピテント大腸菌細胞への変換でゲノムDNAを消化することにより、レポーターコンストラクトをレスキューします。この救済は、元のコンストラクトが制限、消化、およびシーケンシングによって分析された細菌の複製起源を含んでいるために可能です。これらは典型的な事実であり、対照切断の結果、およびNHEJおよびHR実験の結果です。

蛍光強度および蛍光細胞の数は、I SCE 1トランスフェクション細胞では対照群に比べて低い。蛍光シグナルの違いは、これらの細胞におけるGFPおよびDS REDコンストラクトのコピー数の違いによるものです。実験の各セルには、統合レポーター構成体のコピーが 1 つ含まれています。

したがって、修復イベントが成功すると、細胞の一部でGFP遺伝子が再構成されます。NHEJおよびHRの効率は、GFP陽性細胞とDS赤色陽性細胞の比率として計算されます。NHEAは、ヒト細胞のHRよりも効率的なプロセスであり、ヒト線維芽細胞では、NHEJ効率は通常0.6〜1.3、HR効率は0.05〜0.3です。

この技術は、DNA修復の分野の研究者がHEGとHRのさまざまな因子の役割を探求し、哺乳類細胞におけるNHEGとHRの動態と制御を研究する道を開きました。このビデオを見れば、蛍光アッセイを使用して哺乳類細胞のHRとGJの効率と精度を測定する方法について十分に理解できるはずです。