C.エレガンスMovement Tracking:線虫の移動を評価する方法

- C.エレガンスの移動を評価するには、カメラを使用して寒天プレート上の線虫の動きを記録し、記録中にプレートが均一に照らされるようにします。プレートの周りのワームの動きを制限するには、銅のリングを使用します。銅はC.エレガンスに嫌悪感を抱くため、ワームはリング内に囲い込まれます。

複数の銅リングを1つのプレートに配置して、各リング内のワームを同時に追跡します。これにより、対照動物と実験動物の評価を同じ条件下で行うことができ、日々のばらつきを減らし、並べて比較することが可能になります。設定された時間間隔でワームの動きを記録し、コンピューターソフトウェアを使用して、移動速度や移動距離など、機関車の挙動の特徴を分析します。

このプロトコルの例では、ワームの移動速度に対するアルコールの影響をテストする運動追跡アッセイのデモンストレーションを見ていきます。

- まず、2分以内で各実験グループから10匹の線虫を順化板上の銅リングの中心に移します。こちらはエタノール不使用のプレートです。ワームと一緒に食べ物を移すことは、ワームの動きを減らすため、避けてください。また、ワームが穴を掘るので、寒天の表面を傷つけないようにしてください。プレートへのロード時間を記録し、各プレートへのワームの移動を2分以上ずらして、各プレートを適切な時間間隔で個別に撮影できるようにしてください。

各順化プレートを室温で30分間インキュベートします。次に、順化プレート上にワームを配置するために使用した順序に従って、ワームをアッセイプレートに移します。バクテリアを含まない薄いエッジの平らなワームピックを使用して、すくい取り動作を使用して平らなピックの上にワームを集めます。次に、プレートを実験用フィルムで密封して、気化によるエタノールの損失を最小限に抑えます。

- このステップで動物が移送される速度は非常に重要です、なぜなら転移した動物はより長くエタノールにさらされるからです。したがって、実験の反復間でプレート上に最初に配置されるひずみをローテーションすることをお勧めします。

- 現在、ワームを撮影するには、高解像度のビデオカメラを備えた顕微鏡が必要です。3インチ四方のバックライトなどの照明も、分析に不可欠です。次に、コントラストを維持するために、プレートメディア側を上にしてイメージングします。

120フレーム、12ビット、グレースケール、タイムラプスムービーを1秒あたり1フレームでキャプチャするための画像解析ソフトウェアを準備します。十分な画像解像度を維持しながら出力ファイルのサイズを小さくするには、2 x 2 ビニング モードを使用します。

次に、各プレートから2分間のムービーを録画します。これは、最後のワームがそのプレートに置かれてから10分後です。次に、ワームをプレートに置いてから30分後に、2回目の2分間の録音を行います。このデモでは、Image-Pro Plus ソフトウェアを使用しますが、この手法には他のさまざまなソフトウェアを適応させることができます。ムービーを 2 分間のセグメントとして分析します。

まず、背景を平坦化し、ワームオブジェクトのコントラストを強化するフィルターを画像に適用します。メニューで、「プロセス」、「フィルター」、「拡張」、「フラット化」の順に選択します。暗い背景と 20 Pix フィーチャ幅のパラメータを設定します。

次に、各リング内の動物の移動運動を、銅リングと重なる円形の関心領域を使用して個別に解析します。線虫を特定して追跡するには、[測定]サブメニューの[オブジェクトの追跡]コマンドを使用します。

[トラッキング データ テーブル] ウィンドウで、[トラッキング オプション] ボタンを使用して、特定のトラックを除外したり、実験的なアーティファクトを制限したりできます。[Auto Tracking]タブで、トラックパラメータをフレームあたり400ミクロンの速度制限に設定します。[Acceleration limit] を [Automatic] に設定します。

[最小トラック合計長]を 400 ミクロンに設定し、[先行モーション タイプ]を[カオス]に設定します。次に、[Track Parameter] で、オブジェクトを設定して、パーシャル トラックの最小長を 21 フレームに、[Tracking Projection Depth] を 1 フレームに設定します。

ここで、追跡プロセスを開始するには、まず「すべてのトラックを自動的に検索」機能ボタンをクリックします。これにより、[カウント/サイズ オプション] ダイアログ ボックスと [トラッキング] ダイアログ ボックスが表示されます。「カウント/サイズ」ダイアログボックスの「強度範囲選択」で「手動」オプションを選択します。これにより、重要なしきい値ステップが提供されます。次に、[強度しきい値]スライダーを調整して、暗いオブジェクトを強調表示する包括的な範囲を作成します。スケールの適切な開始点は 0 から 1,500 の間です。

次に、サイズフィルターを適用して、単一のワームよりも大きいまたは小さいオブジェクトを除外します。[測定]メニューに移動し、[測定]サブメニューを選択します。これにより、[カウント/サイズ オプション] ダイアログ ボックスが開きます。そこで、エリア範囲を 28,000 から 120,000 平方メートルに設定します。そして、周囲範囲を600〜2,500ミクロンに設定します。異常なサイズのワームを使用する場合は、これらのパラメータを調整してください。

次に、追跡ダイアログボックスで[続行]をクリックして、追跡プロセスを完了します。出力がムービー映像とトラックされていることを再確認してください。フィルタリングする明確な理由がない限り、すべてのワームが表されていることを確認してください。次に、ワーム以外のオブジェクトによって生成されたトラックを手動で削除します。

次に、各フレーム間または各秒の移動距離を平均して各ワームの速度を計算し、各母集団のトラックの平均速度を作成します。この最終平均を、実験の統計分析のための 1 サンプル点と考えてください。