ハンギングドロップ法:3次元黒色腫スフェロイドを生成する技術

- スフェロイドは、in vivo腫瘍の構造を模倣し、腫瘍内相互作用の研究に役立つ3次元のin vitro細胞培養モデルです。培養をセットアップするには、まず、適切な培地でメラノーマ細胞の単一細胞懸濁液を調製します。次に、この細胞懸濁液を少量、滅菌済みの非接着性培養皿の蓋の内面に十分に離して見つけます。フタを丁寧に反転させ、PBSが入った培養皿の底面に乗せると、水分補給室ができあがります。適切な条件下でプレートをインキュベートします。

PBSからの水分は、吊り下げられた液滴からの媒体の蒸発を防ぎます。数マイクロリットルのメディアを交換して、ドロップをリフレッシュします。表面張力により、液滴は球形を維持し、プレートの内面から吊り下げられたままになります。重力により、細胞は拡散せずに懸濁液に留まり、液滴内で凝集して三次元スフェロイドを形成します。最後に、液滴をPBSですすいで、スフェロイドを採取します。それらを非粘着性の培養皿に集めます。

以下のプロトコールでは、ハンギングドロップ法による451-LUメラノーマ細胞の三次元スフェロイドの生成を実演します。

- まず、一般的な細胞培養プロトコルに従って、10%FCSを含有するRPMI培地を使用してメラノーマ細胞451-LUを培養します。メラノーマスフェロイドを作製するには、培養したメラノーマ細胞をPBSで洗浄します。次に、PBSに5ミリリットルの1x Trypsin-EDTAを加えます。室温で3〜5分間インキュベートします。トリプシンを中和するために、10%FCSを含む5ミリリットルのRPMIを追加します。次に、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。200 x gで5分間遠心分離し、細胞を回収します。10%FCSを含むRPMIに細胞ペレットを再懸濁します。

次に、細胞をカウントし、細胞懸濁液を最終濃度の10,000細胞/ミリリットルに希釈します。電動マルチピペットを使用して、無菌の非粘着性10cm細胞培養皿の蓋の内面に40 x 25マイクロリットルの細胞懸濁液のスポットを作成します。

次に、素早く滑らかな動きで蓋を裏返し、5ミリリットルのPBSが入った細胞培養皿の上に置きます。吊り下げ式ドロップディッシュを摂氏37度で5%の二酸化炭素で10〜14日間培養します。

最初のドロップスポッティングから5日後に、電子ディスペンサーを使用して、10%FCSを含む10マイクロリットルのRPMIを各ドロップに追加します。10〜15日後、PBSで蓋からスフェロイドをやさしく洗い流して、スフェロイドを採取します。スフェロイドを新鮮な非接着性の細胞培養皿に集めます。