Name: 大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-21T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: 学ぶマイクロエクスプラント培養法による骨格筋幹細胞の単離技術。マウスの成体筋肉と胚から増殖性幹細胞を取得し、再生医療や筋肉疾患研究への応用可能性を探る方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我々はshRNAiシャトルベクターの彼の贈り物のためにパトリックパディソンに感謝。アンジェラスローンは、 図3のGFPのRNAi画像を生成する。我々はまた彼らのサポートについては、次の助成団体に感謝： 筋ジストロフィーキャンペーン承認番号RA2/592/2は、承認番号02BHM04、王立協会の助成金番号574006.G503/1948./JEとBBSRCの助成金番号6/SAG10077スパークス。

<ol><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1997).</li>
<li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li>
<li>Smith, J., Schofield, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+fibroblast+growth+factors+in+long+term+primary+culture+of+dystrophic+%28mdx%29+mouse+muscle+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of fibroblast growth factors in long term primary culture of dystrophic (mdx) mouse muscle myoblasts.</a> Exp Cell Res. 210, 86-93 (1994).</li>
<li>Fell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell in culture.</a> J Clin Pathol. 11, 489-495 (1958).</li>
<li>Stewart, D. C., Kirk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+measurement+of+several+parameters+of+embryo+heart+explants+growth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The simultaneous measurement of several parameters of embryo heart explants growth in vitro.</a> J Cell Physiol. 40, 183-198 (1952).</li>
<li>Harvey, A. L., Robertson, J. G., Witkowski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+skeletal+muscle+fibres+in+explant+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Maturation of human skeletal muscle fibres in explant tissue culture.</a> J Neurol Sci. 41, 115-122 (1979).</li>
<li>Zammit, P. S., Heslop, L., Hudon, V., Rosenblatt, J. D., Tajbakhsh, S., Buckingham, M. E., Beauchamp, J. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+myoblast+proliferation+show+that+resident+satellite+cells+are+competent+to+fully+regenerate+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetics of myoblast proliferation show that resident satellite cells are competent to fully regenerate skeletal muscle fibers.</a> Exp Cell Res. 281, 39-49 (2002).</li>
<li>Konigsberg, I. The embryonic origin of muscle. , McGraw-Hill. New York. (1986).</li>
<li>Trainor, P. A., Tan, S. S., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm%3A+regionalization+of+cell+fate+and+impact+on+craniofacial+development+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm: regionalization of cell fate and impact on craniofacial development in mouse embryos.</a> Development. 120, 2397-2408 (1994).</li>
<li>Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+genetic+hierarchies+controlling+skeletal+myogenesis+Pax-3+and+Myf-5+act+upstream+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD.</a> Cell. 89, 127-138 (1997).</li>
<li>Tremblay, P., Dietrich, S., Mericskay, M., Schubert, F. R., Li, Z., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+Pax3+in+the+development+of+the+hypaxial+musculature+and+the+longrange+migration+of+muscle+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A crucial role for Pax3 in the development of the hypaxial musculature and the longrange migration of muscle precursors.</a> Dev Biol. 203, 49-61 (1998).</li>
<li>Tajbakhsh, S., Bober, E., Babinet, C., Pournin, S., Arnold, H., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+the+myf-5+locus+with+nlacZ+reveals+expression+of+this+myogenic+factor+in+mature+skeletal+muscle+fibres+as+well+as+early+embryonic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gene targeting the myf-5 locus with nlacZ reveals expression of this myogenic factor in mature skeletal muscle fibres as well as early embryonic muscle.</a> Dev Dyn. 206, 291-300 (1996).</li>
<li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+pattern+of+prospective+somites+in+the+presomitic+mesoderm+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A study of the pattern of prospective somites in the presomitic mesoderm of mouse embryos.</a> J Embryol Exp Morphol. 92, 269-285 (1986).</li>
<li>Cossu, G., Kelly, R., Donna, S. D. i, Vivarelli, E., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+differentiation+during+mammalian+somitogenesis+is+dependent+upon+a+community+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Myoblast differentiation during mammalian somitogenesis is dependent upon a community effect.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92, 2254-2258 (1995).</li>
<li>Shainberg, A., Yagil, G., Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myogenesis+in+vitro+by+Ca2%2B+concentration+in+nutritional+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Control of myogenesis in vitro by Ca2+ concentration in nutritional medium.</a> Exp Cell Res. 58, 163-167 (1969).</li>
<li>Dodson, M. V., Martin, E. L., Brannon, M. A., Mathison, B. A., McFarland, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bovine+satellite+cell-derived+myotube+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Optimization of bovine satellite cell-derived myotube formation in vitro.</a> Tissue Cell. 19, 159-166 (1987).</li>
<li>Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Growth+factors%2C+ubiquitin+and+apoptosis+in+dystrophic+muscle%3A+Apoptosis+declines+with+age+in+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22B+Appl+Myol%22%5BJournal%5D)">Muscle Growth factors, ubiquitin and apoptosis in dystrophic muscle: Apoptosis declines with age in the mdx mouse.</a> B Appl Myol. 6, 279-284 (1996).</li>
<li>Smith, J., Fowke, G., Schofield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+dystrophic+%28mdx%29+muscle+is+inhibited+by+IGF-II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in dystrophic (mdx) muscle is inhibited by IGF-II.</a> Cell Death Differ. 2, 243-251 (1995).</li>
<li>Smith, J., Schofield, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+an+mdx+skeletal+muscle+cell+line+into+dystrophic+%28mdx%29+skeletal+muscle%3A+evidence+for+stem+cell+status%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Stable integration of an mdx skeletal muscle cell line into dystrophic (mdx) skeletal muscle: evidence for stem cell status.</a> Cell Growth Differ. 8, 927-934 (1997).</li>
<li>O Shea, L., Johnson, C., Rooney, M., Gleeson, R., Woods, K., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+skeletal+muscle+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and skeletal muscle ageing.</a> Mech Ageing Dev. 122, 1354-1355 (2001).</li>
<li>Merrick, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+role+for+Igf-2+in+fast+skeletal+muscle+specification+during+myogenesis+in+dystrophic+and+wild+type+embryos+%5B%5D%22">A role for Igf-2 in fast skeletal muscle specification during myogenesis in dystrophic and wild type embryos [dissertation]</a>. , University of Birmingham. Birmingham. (2006).</li>
<li>Stadler, L. K. J., Merrick, D., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+stem+cell+and+fast+myosin+abnormalities+in+the+cav-3+%2F+and+mdx+dystrophic+embryo+reveal+an+embryonic+basis+for+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Abstr.+Genet.Res%22%5BJournal%5D)">Morphological stem cell and fast myosin abnormalities in the cav-3 / and mdx dystrophic embryo reveal an embryonic basis for muscular dystrophy.</a> Abstr. Genet.Res. 90, 281-289 (2008).</li>
<li>Merrick, D., Stadler, L. K. J., Larner, D. P., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+stem+cell+and+fast+myosin+abnormalities+in+the+cav-3+%2F+and+mdx+dystrophic+embryo+reveal+an+embryonic+basis+for+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Morphological stem cell and fast myosin abnormalities in the cav-3 / and mdx dystrophic embryo reveal an embryonic basis for muscular dystrophy.</a> Dis Model Mech. 2, 374-388 (2009).</li>
<li>Matschak, T., Stickland, N. C., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explants+of+embryonic+Atlantic+salmon+muscle+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+A%22%5BJournal%5D)">Explants of embryonic Atlantic salmon muscle in culture.</a> Proc Soc Exp Biol A. 1, 23-23 (1997).</li>
<li>Smith, J., Hooper, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominance+and+independent+segregation+of+metabolic+cooperation+competence+and+pluripotency+in+an+embryonal+carcinoma+cell+hybrid%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dominance and independent segregation of metabolic cooperation competence and pluripotency in an embryonal carcinoma cell hybrid.</a> Exp Cell Res. 181, 40-50 (1989).</li>
<li>Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+linked+muscular+dystrophy+%28mdx%29+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X chromosome linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81, 1189-1192 (1984).</li>
<li>Hagiwara, Y., Sasaoka, T., Araishi, K., Imamura, M., Yorifuji, H., Nonaka, I., Ozawa, E., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-3+deficiency+causes+muscle+degeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Caveolin-3 deficiency causes muscle degeneration in mice.</a> Hum Mol Genet. 9, 3047-3054 (2000).</li>
<li>Westbury, J., Watkins, M., Ferguson-Smith, A. C., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+temporal+and+spatial+regulation+of+the+cdk+inhibitor+p57+%28kip2%29+during+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic temporal and spatial regulation of the cdk inhibitor p57 (kip2) during embryo morphogenesis.</a> Mech Dev. 109, 83-89 (2001).</li>
<li>Merrick, D., Ting, T., Stadler, L. K. J., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Insulin-like+growth+factor+2+in+specification+of+the+fast+skeletal+muscle+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for Insulin-like growth factor 2 in specification of the fast skeletal muscle fibre.</a> BMC Dev Biol. 7, 65-65 (2007).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells+AQ4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells AQ4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1443-1448 (2002).</li>
<li>Smith, J., Merrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle+Microexplant+Culture+and+Isolation+of+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 633, (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

マイクロダイセクション外植片培養を確実かつ再現性良く増殖Myf - 5正の骨格筋幹細胞（SMSC）の非常に高い割合（〜85％）を含む細胞集団を分離するために使用することができます。厳密に制御された培養条件下で一次外植培養を遺伝的変異マウスのSMSCの成長挙動を特徴付けるために使用することができると分化過程のin vitroでの解析の詳細のための筋管を生成する手段として使用することができますここで説明する。これらの培養物の入念なメンテナンスや操作は、長期培養と拡張することができます。メソッドを使用すると、単一のセルの希釈によって外植片培養物からのクローナルな骨格筋幹細胞株を導出することも可能ですここで説明する。 &quot;馴化培地&quot;は、高密度培養のためのこれらの細胞の正常な要件を模倣するために使用され、クローニング手順の間に分離された単一細胞の増殖を達成するために。方法は（胚、成人、老人、成体組織に（変更あり）に適用され、マウスに加えて、人間（ラオとスミス、未発表）を含む他の種の骨格筋から細胞、ニワトリ胚や魚を隔離するために使用することができます。鮭）24。クローン由来のSMSCは、筋肉内移植によるin vivoで解析することができますし、注入されたこれらの条件下で、SMSCは、ハイブリッド筋線維を形成するためにホストの筋管で結合します。筋肉内注射SMSCは、腫瘍を形成しないと彼らは衛星幹細胞niche.These細胞による内在性コントロールの対象となることを示唆し、注入後の年以上の衛星細胞の位置にホストの筋肉で発見されている注入から再単離することができる12カ月以上19ホストの注入後の増殖SMSCのようなホスト。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 1:1混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>液体培地：（Dulbecco&amp;rsquo;修飾イーグル（Modified Eagle's）&amp;rsquo;s培地およびHam&amp;rsquo;F12培地、1:1 v/v)</td></tr><tr><td>100&amp;#215; グルタミン (200mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>培地で1にまで希釈し&amp;#215; 濃度2 mM (Glutamine HYBRI-MAX R)</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清 (FCS)</td><td>複数の異なるメーカーから</td><td></td><td>初代培養細胞および骨格筋細胞株でバッチテスト済み。液体培地への添加濃度は10〜20％。</td></tr><tr><td>Heraeus Labofuge 300</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>1,000 rpmまで到達可能なラボ用遠心分離機</td></tr><tr><td>15 ml Falcon遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>ラボ用遠心機に適合すること</td></tr><tr><td>組織培養用プラスチック器具（25、75、または175 $\text{mm}^2$の組織培養容器、96ウェル組織培養プレート、60 mmペトリ皿）。</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; インキュベーター (Heraeus)</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>当社の製品は銅ライニングが施されており、汚染の低減に推奨されます。</td></tr><tr><td>層流クリーンベンチ（Heraeus）</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>当施設ではクラスII安全キャビネットを使用しています。 &amp;#8211; ヒト組織への使用に適している</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>助成金による設備</td><td></td><td>常に37℃に維持する&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td>滅菌（動物、解剖器具）および作業台、フードなどの拭き上げ用。 </td></tr><tr><td>カルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>細胞培養試験済みPBS (Dulbecco&amp;rsquo;(処方)は、混合済み粉末または錠剤の形態で購入し、オートクレーブで滅菌する前に2回蒸留水で調製します。PBSは、2.68 mM 塩化カリウム (KCl)、1.47 mM リン酸一カリウム (KH2PO4)、0.137 M 塩化ナトリウム (NaCl)、および 8.1 mM リン酸二ナトリウム (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;高倍率光学顕微鏡（HPO）&lt;sub&gt;4). PBSは以下の手順で調製できます：KCl 200 mg、KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、8 gのNaClおよび1.15 gのNa&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ハイパーパラメータ最適化&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;の二回蒸留水に加え、オートクレーブによる滅菌を行う。&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>クライオチューブ vial</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノイバウエル血液球計数器およびカバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>細胞数算定のために</td></tr><tr><td>手動カウンター</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡、Zeiss Stemi 1000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>外植体（エクスプラント）の調製について</td></tr><tr><td>小型滅菌フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌済みの解剖器具（ジュエラーズ鉗子を含む&amp;rsquo;ピンセット)</td><td></td><td></td><td>オートクレーブによる滅菌</td></tr><tr><td>滅菌済みプラスチック採取容器（7 mlビジューチューブまたは20 mlユニバーサルチューブ）</td><td>Nalge Nunc International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温間PECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>滅菌フード内で調製し、37℃まで加温した。&amp;#x00B0;組織培養用ウォーターバス内でのC。20% FCS、1%グルタミン、および1%ペニシリンを添加したDMEM:F-12。 &amp;アンピシリン・ストレプトマイシン溶液</td></tr><tr><td>ディスパーゼ (50 &amp;mu;g/ml（6 units/mgに相当） </td><td>MP Biomedicals（英国）より入手可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;g/ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>アポトーシスおよび有糸分裂の顕微鏡視覚化のために</td></tr><tr><td>Vectashield蛍光封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外線フィルター付き正立型蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse E600を使用）</td><td>ニコン製機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラおよびイメージングソフトウェア（本手法ではNikon Coolpix 995およびNikon D3カメラを使用）</td><td>ニコンインストルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OpenLab4.0aソフトウェア</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大人と胚骨格筋のmicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

培養胚と成体の骨格筋細胞は、異なる用途の数を持っている。この章で説明するミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞の比較的大きな数字を隔離するための堅牢で信頼性の高い方法です。著者らは、野生型およびジストロフィー筋の骨格筋細胞の増殖特性を分析するためのマイクロ解剖外植片培養を使用している。組織の成​​長の各コンポーネント、すなわち細胞生存、増殖、老化や分化は、ここで説明する方法を使用して個別に分析することができます。成長のすべてのコンポーネントの正味の効果は、外植片の伸長率を測定する手段を確立することができます。マイクロ植方法はここで説明されているように、さまざまな筋肉の種類と幅広い年齢層からの初代培養を確立するために使用することができ、胚骨格筋の前駆体の分離を有効にするために、著者によって組み込まれています。 一意に、マイクロ植培養は生体移植のために拡大して使用することができる骨格筋幹細胞（SMSC）の行をクローン（単一細胞由来）を導出するために使用されている。 生体内に移植SMSCがとしての機能、組織特異的、衛星細胞の動作をこれは、骨格筋線維の再生に貢献するだけでなく、マイクロ植法を用いて培養に再単離することができる未分化幹細胞の小さなプールのように（サテライト細胞のニッチで）保持されている。

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

培養された胚および成人の骨格筋細胞は、多くの異なる用途に利用されています。本章で述べるマイクロダイセクションによる外植片（エクスプラント）作製法は、...

本手順の全体的な目的は、成体筋肉または胚から得られた微小解剖組織移植片から、骨格筋幹細胞の濃縮集団を単離し、その挙動と機能を研究することである。これらの細胞は治療目的で利用される可能性もある。まず、無菌条件下で、成体マウスの死骸または子宮組織からの胚から標的筋肉を解剖して取り出すことでこれを達成する。手順の第2段階では、成体筋肉組織の場合は筋肉組織を洗浄・清浄し、脂肪および結合組織を切り出します。胚の場合は、新鮮なDF 20培地に移します。外膜と内臓を取り除いて新鮮なDF 20培地に移した後、解剖して筋肉が豊富な領域を分離します。手順の第3ステップは、分離した組織を400 µmの立方体にマイクロダイセクションすることです。外植片を96ウェルプレートの中央60ウェルに1つずつ移し、37 °Cでインキュベートします。手順の最終ステップは、細胞のスコアリングを行うことです。組織の由来によって異なりますが、成功したx外植片からは、外植後数時間から最大2週間で細胞が出現し始めます。最終的に、成功したX外植片から細胞が出現し始める様子を確認でき、これらの細胞を増殖させて、増殖やアポトーシスの研究、およびタンパク質マーカーの同定を含む、さまざまなin vitroおよびin vivoの目的に利用することが可能です。また、これらの細胞はクローン由来にしたり、遺伝子改変を施したりすることができ、最終的に宿主に移植して再生の研究や治療法の試験に利用することも可能です。こんにちは。バーミンガム大学バイオサイエンス学部、骨格筋幹細胞生物学研究室のジャネット・スミスです。ジャネット・スミス研究室のディーン・ラナです。同じくジャネット・スミス研究室のバイロン・チェンです。本日は、成体筋および胚から得られたMicrodissect Xファットから骨格筋幹細胞の培養を得るための手順をご紹介します。本手順は、骨格筋幹細胞の増殖、アポトーシス、分化などの挙動の解析や、筋ジストロフィーなどの疾患における筋幹細胞の機能異常の研究に研究室で利用されています。それでは、始めていきましょう。骨格筋からマイクロエクスプラント培養を誘導するための基本手法は、無菌条件下で、新鮮な冷却マウスから標的筋肉を解剖することから始まります。このデモンストレーションでは、後肢の筋肉を解剖し、DF 20培地を2回交換して単離した筋肉を洗浄した後、60mmディッシュに入れた新鮮なDF 20培地に移します。実体解剖顕微鏡を用い、無菌状態で、脂肪結合組織や骨を除去するように筋肉を注意深く微小解剖します。次に、精密ピンセットを使用して、洗浄した筋肉片を400µmの立方体状に切断します。筋肉片を、DF 20を50 µLずつ分注した96ウェルプレートの中央60ウェルに個別に配置します。組織片が入っていないウェルには、乾燥を防ぐために生理食塩水を満たします。顕微鏡でウェルを確認し、その後、96ウェルプレートを37 °C、5% CO2 インキュベーターに入れます。マイクロ外植片（explant）の接着と増殖のスコアリングは、24～48時間の培養後に行い、その後は培養している筋肉の増殖速度に応じて48～72時間の間隔で実施します。ここでは、成人の骨格筋外植片から得られた2日目の増殖例と、凝集した培養物と高い細胞密度を持つ確立された外植片増殖の例を示します。外植片は、各ウェル内の細胞のコンフルエンスレベルに従ってスコアリングされており、これは後述するSMS細胞の拡大および単離において実演されます。アウトグロース培養では、主にSMS細胞の形態、すなわち高い屈折率を持ち、凝集したクラスターとして増殖する球形の単核細胞を持つ細胞がないか、個別にモニタリングする必要があります。まず、子宮からE 12.5胚を摘出することからこの手順を開始します。E 11.5からE 17.5段階の胚も同様の方法で摘出することが可能です。詳細なマイクロダイセクションに備え、胚を個別にPECMを含むペトリ皿に配置します。次に、個々の胚をさらに解剖し、骨格筋が豊富な領域を単離します。まず、内臓を取り除き、尾部、後肢、および身体の上壁と下壁を切り出します。解剖したすべての組織を新しいPECMに入れ、胚を浸します。マイクロエクスプラント培養のため、解剖した4本の肢、後肢、および上下の体壁をマイクロダイセクションし、等しいサイズの小さな組織立方体を作成します。これらのマイクロエクスプラントを、1ウェルあたり50 µLのPECMを含む96ウェルプレートの中央60ウェルに、個別に配置します。胚の培養には、研究対象となる胚1個につき、1ウェルあたり1植物体を含む少なくとも60ウェルを設ける必要があります。中央の60ウェルを、外植体が由来する部位を示す領域に分割します。この設計により、肢、上部体壁、後肢、および下部体壁に対して、それぞれ15ウェルずつを割り当てることができます。外植片を37°C、5%二酸化炭素条件下で3週間培養します。3週間の培養期間中、倒立顕微鏡を用いて、培養3日目、7日目、14日目、および21日目に外植片の評価を行います。外植片の評価は、各ウェルにおける細胞のコンフルエンスレベルに基づいて行います。この例では、MitoTracker Red CMXRosで染色したE 15.5一次胚外膜（explan）培養における、14%、15〜24%、25〜49%、50〜74%、および75〜100%の様々なコンフルエンスレベルを示しています。また、培養の写真撮影も可能です。SMS細胞の形態学的特徴を示すコンフルエントな胚外膜培養は、継代培養することができます。選択したウェルから培地を除去し、0.2 µm ACRディスクシリンジフィルターを用いてろ過してください。各ウェルの条件付け培地として、保存しておいた培地を使用します。PECMで10倍に希釈したディスク液を100 µLずつ添加します。その後、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻し、20分間静置します。20分後、ピペットチップを使用して、ウェル表面から剥離した細胞を優しく掻き取り、次いで細胞懸濁液を1000 ×gで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。細胞を2 mLのPECMで再懸濁して希釈し、新しい48ウェルプレートのウェルに分注します。最後に、さらなる拡大培養のため、細胞混合液を48ウェルプレートに移します。解析用プレートのディスプレイサブカルチャーを調製するため、PECMおよびコンディショニング培地を用いた初代胚性Splunk培養物を、48ウェルプレート内のカバースリップ上に播種します。細胞は3 × 10³ cells/cm²の密度で播種し、37 °Cのインキュベーター内で細胞を接着させます（通常4〜6時間かかります）。アポトーシスおよび増殖の評価のため、カバースリップ上の細胞をPBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。固定後、カバースリップをPBSで10分間洗浄し、その後10 µg/mLのDPIで3分間染色します。プレートをホイルで包み、カバーガラスをPBSで5〜10分間洗浄します。その後、ウェルからカバーガラスを取り出し、ガラススライド上のDaco Cyto（マウント剤）のスポット上に反転させて載せます。保存のために、カバーガラスの端をマニキュアで封止します。スライドをアルミホイルで包み、計数のため-20°Cで保存します。正立顕微鏡を用いて蛍光観察を行い、IPグレードを用いてアポトーシス細胞および有糸分裂細胞をスコアリングします。成体骨格筋または胚から外植片を慎重に採取して植え付けた場合、37°Cで数時間から72時間インキュベートすると細胞の生成が始まります。由来に応じて、胚移植では数日、より高齢の骨格筋移植では数週間にわたって細胞集団の拡大が行われ、高密度に凝集したSMS細胞の一次培養が作製されます。ここでは、SMS細胞のクローン分離に成功した代表的な結果を示します。96ウェルプレートに単離された単一の細胞は、単一細胞由来のコロニーとなり、最終的に確立されたクローン集団となります。その後、MIF5免疫組織化学染色を用いてSMS細胞の同一性を確認します。骨格筋由来の成体幹細胞をホストマウスの前脛骨筋に移植し、注入後3ヶ月に撮影したこの画像では、これらの細胞がbeta GC標識によって同定されています。注入後14ヶ月では、筋肉繊維において青色に染色された、最近融合した3つのbeta galacto陽性細胞が観察されます。また、茶色に染色されたanti beta galacto抗体により、筋肉繊維におけるbtic galacto陽性細胞の広範な寄与が検出されています。この画像では、矢印でbeta galacto陽性サテライト細胞が示されています。注入後12ヶ月に注入したホスト筋肉から単離し、一次抗体を使用しなかったコントロールでは、染色は認められません。マウス由来のクローナルSMS細胞株において、β-galacto陽性細胞の増殖培養による核型分析を行った結果、正常な二倍体染色体補完であることが明らかになりました。PD 50 A細胞のコロニーにおけるβ-galactoの発現を組織化学的に示しています。ジストロフィー胚性Myf5陽性筋芽細胞のin vitro解析により、これらの筋芽細胞は過剰増殖し、アポトーシスを起こしやすいことが分かりました。このグラフに示すように、Muscle Xエクスプラン培養からの胚性筋芽細胞の増殖速度は、野生型エクスプランと比較して、MDXおよびCAV3ノックアウト変異体の両方で増加しています。こちらにMyf5免疫染色のエクスプランの例を示します。Ki67陽性の免疫反応性により判定した結果、これらMDXおよびCAV3ノックアウト変異体において胚性筋芽細胞の過剰増殖が観察されました。さらに、DPI染色で示されているように、これら両方の変異体においてアポトーシスの亢進が認められ、この画像では矢印で示されたアポトーシス細胞の例を示しています。以上で、成体および胚のマイクロダイセクション組織片から骨格筋幹細胞を単離する方法について説明しました。この手順を行う際は、マイクロダイセクションした組織片のサイズに注意することが重要です。サイズが大きすぎると、過密状態となり細胞が死滅します。逆に小さすぎると、細胞の良好な増殖を維持することができません。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

adult-embryonic-skeletal-muscle-microexplant-culture-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

フラスコに細胞の付着の速度に基づいて、筋骨格系の軟部組織から成体幹細胞を単離する。...

ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。...

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

このプロトコルは、成人および高齢者の骨格筋からの単離および筋芽細胞の前駆細胞の培養の、堅牢で再現性と簡単な方法について説明します。ここで使用される筋肉は足と脚の筋肉を含みます。このアプローチは、機能的研究のための一次筋芽細胞の濃縮集団の単離を可能にします。...

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。...

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

ミオブラストは、多核化ミオチューブと最終的に骨格筋筋筋筋繊維を形成するために分化する前駆細胞を増殖させる。ここでは、若年成人マウス骨格筋からの原発筋芽生の効率的な単離および培養のためのプロトコルを提示する。この方法は、培養中の筋肉細胞の分子的、遺伝的、代謝的研究を可能にする。...

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。...

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。...

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex...

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶマイクロエクスプラント培養法による骨格筋幹細胞の単離技術。マウスの成体筋肉と胚から増殖性幹細胞を取得し、再生医療や筋肉疾患研究への応用可能性を探る方法です。

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

さらに動画を探す