TALEN媒介標的遺伝子組み込み:hiPS細胞への蛍光タンパク質遺伝子の精密挿入のための遺伝子組換え配列特異的ヌクレアーゼの使用

まず、培地中のヒト人工多能性幹細胞またはhiPSC懸濁液から始めます。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはTALENをコードするプラスミドのペアを添加します。蛍光タンパク質遺伝子を担い、抗生物質耐性遺伝子と結合したドナープラスミドを、標的遺伝子座に特異的にアラインメントするための隣接ホモロジーアームで補います。

混合物をエレクトロポレーションして細胞膜に一過性の細孔を生成し、プラスミドの内在化を可能にします。細胞内に入ると、TALENをコードするプラスミドがプロセシングされ、非特異的なFokI制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインに融合した部位特異的なTALE DNA結合ドメインで構成されるキメラタンパク質であるTALENが生成されます。

各TALENモノマーは、そのDNA結合ドメイン(タンデムアミノ酸リピートモジュールを含む)を介して、スペーサー配列によって分離された各DNA鎖上の反対の配向で、ヌクレオチドごとに1つのモジュールである標的遺伝子座を認識して結合します。その後、FokIドメインはスペーサー配列内でDNAを二量体化して切断し、オーバーハングを伴う二本鎖切断を形成します。

切断部位に隣接する領域に相補的な相同性アームを含むドナープラスミドの存在下では、二本鎖切断を架橋するDNA修復合成のテンプレートとして相同配列を利用して相同性発現修復が起こります。ニックのライゲーションに続いて、介在する蛍光タンパク質と抗生物質耐性遺伝子が宿主ゲノムに組み込まれます。

増殖をサポートするためにフィーダー細胞層に播種されたhiPSCを、抗生物質含有培地で処理します。プロモーターレスの抗生物質耐性遺伝子は、上流の内因性プロモーターによって駆動され、TALEN編集細胞の選択を促進します。