モルフォリノ媒介遺伝子編集:単細胞洞窟魚卵におけるトランスレーショナルブロッキングモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子ノックダウン技術

モルフォリノは、天然のヌクレオチドと比較して、リン酸骨格と糖構造が異なる、短い一本鎖再設計されたオリゴヌクレオチドです。これらの特徴により、生理的pHでのモルフォリノスの安定性が向上します。これらのバリエーションにもかかわらず、モルフォリノには標準的な核酸塩基が含まれており、ノックダウンする目的の標的遺伝子の特定のmRNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドを設計するのに役立ちます。

モルフォリン駆動の遺伝子編集を行うには、まず、アガロース注入プレートのウェル内に配置された単細胞の洞窟魚の卵を採取します。半透明で丸い卵を視覚化して、卵黄嚢(卵の内部に存在する液体で満たされた構造)を見つけます。

設計されたモルホリノを含む溶液をあらかじめ充填したマイクロインジェクション針を取ります。溶液を卵黄に直接注入し、モルフォリノが細胞質に入ることを確認します。細胞内では、標的遺伝子がmRNAを形成し、細胞質に輸送されます。

細胞質内では、注入されたモルフォリノは、内因性開始部位でその相補的標的mRNA転写産物とハイブリダイズし、それを超えて広がっています。このプロセスは、リボソームのより大きなサブユニットと、いくつかの特定のタンパク質と複合体を形成した小さなリボソームサブユニットからなる新生の翻訳開始複合体との結合をブロックします。

その後、翻訳開始複合体の進行が立体的に妨げられ、mRNAのタンパク質への翻訳が停止します。最後に、モルフォリノスによる翻訳ブロッキングにより、標的タンパク質濃度が低下します。