ヒトiPS細胞におけるPiggyBacトランスポゾン媒介遺伝子編集:PiggyBacトランスポゾンシステムを用いたヒトiPS細胞への目的遺伝子統合の手順

まず、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)を適切なエレクトロポレーションバッファーに懸濁液で溶解します。PiggyBacトランスポザーゼをコードするプラスミドとドナープラスミドからなる溶液を添加します。混合物をエレクトロポレートします。

電気パルスは細胞膜を一過性に透過し、プラスミドの細胞内取り込みを促進します。ドナープラスミドは、トランスポゾン特異的な逆末端反復配列(ITR)で構成されており、これらは互いに逆に補完し、標的タンパク質と抗生物質耐性遺伝子を囲むTTAA反復配列に隣接しています。

発現したPiggyBacトランスポゼースタンパク質は、ITRの3'末端にTTAAリピートの内部に切り傷を生じます。露出した3'-ヒドロキシル基は、隣接するDNA内の相補鎖のヌクレオチドを攻撃し、トランスポゾン末端にTTAAヘアピンを形成し、それによってプラスミドからトランスポゾンコンストラクトを放出します。

トランスポゼースはヘアピンを分解して、トランスポゾンコンストラクトの 5' 端に TTAA オーバーハングを形成します。トランスポゼースはさらに、宿主ゲノムのTTAA配列で二本鎖切断を作成します。放出された3'-ヒドロキシルトランスポゾン末端は、千鳥状末端でTTAA配列を攻撃し、トランスポゾンコンストラクトが宿主ゲノムに共有結合し、トランスポゾンコンストラクトに隣接する一本鎖ギャップが残ります。宿主DNAのこれらのギャップはライゲーションされ、トランスポゾンコンストラクトの安定した統合につながります。

細胞外マトリックスタンパク質コーティングプレートに播種したヒトiPS細胞を抗生物質含有培地で処理します。アップストリームのプロモーターによって駆動される抗生物質耐性遺伝子は、遺伝子編集された細胞の選択を可能にします。