CRISPRコンカテマー媒介による複数遺伝子ノックアウト:マウス腸細胞における非相同末端結合経路により複数の遺伝子を同時にノックアウトする技術

CRISPR-concatemer-Cas9システムを使用して複数の遺伝子を同時にノックアウトするには、まずマウスの腸細胞懸濁液が入ったチューブから始めます。チューブに、互いに隣接して統合された複数のガイドRNA(gRNA)の発現カセットを含むCRISPRコンカテマーベクターを補充します。

各gRNAカセットは、目的の遺伝子を個別にノックアウトするようにカスタム設計されています。Cas9エンドヌクレアーゼをコードする発現ベクターを同じチューブに添加します。細胞-プラスミド混合物をエレクトロポレートする - 電流を使用してプラスミドの細胞への侵入を容易にする技術。細胞内では、CRISPRコンカテマーとCas9ベクターの共発現により、それぞれgRNA配列とCas9ヌクレアーゼが形成されます。

各gRNA配列は、対応するCas9酵素に結合し、宿主ゲノムの標的部位に結合する複数のCas9-gRNA複合体を形成します。この結合によりCas9酵素が活性化され、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)部位の上流にある両方のDNA鎖にニックが生じます。これにより、標的DNAに二本鎖切断(DSB)が生じます。

標的遺伝子と相同な配列がない場合、細胞の内因性修復メカニズム(非相同末端結合)が引き起こされ、修復タンパク質とキナーゼ分子が切断部位で結合できるようになります。その後、リガーゼ酵素がDSBを修復し、標的遺伝子配列の修飾をもたらします。これらの修飾は遺伝子の機能を混乱させ、複数の遺伝子のノックアウトをもたらします。