TALEN媒介標的遺伝子組み込み:hiPS細胞への蛍光タンパク質遺伝子の精密挿入のための遺伝子組換え配列特異的ヌクレアーゼの使用

まず、iPSC培養物をPBSで1回ずつ洗浄し、次に各ウェルに37°Cの穏やかな細胞解離試薬1ミリリットルを加え、細胞を37°Cで約5分間インキュベートします。細胞の50%以上が培養容器から解離した場合は、P1000ピペットを使用して、残っている細胞塊または付着した細胞を機械的に破壊します。次に、各ウェルに2ミリリットルのE8培地を加え、10ミリリットルのピペットを使用して、培養物をさらに単一細胞懸濁液に分解します。

次に、採取した細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに注ぎ、スピンダウンします。ペレットを最小限のE8培地に再懸濁してカウントします。その後、トリパンブルー排除により培養物の生存率を確認し、十分な解離が得られていることを確認した後、300万個の細胞を2本の15ミリリットルの円錐管にそれぞれ移します。

細胞を遠心分離している間に、エレクトロポレーションシステムをヒト胚性幹細胞株H9の細胞タイプ特異的プログラムに設定します。次に、対照サンプルのペレット1個に相同組換えドナーのみ10マイクログラムを添加し、実験サンプル用に10マイクログラムの相同組換えドナープラスミドと各TALENプラスミド5マイクログラムを添加します。

次に、100マイクロリットルの室温完全P3初代細胞トランスフェクション溶液を各コントロールペレットおよび実験ペレットに添加し、細胞を再懸濁します。サンプルを個々のキュベットに移し、次にサンプルをエレクトロポレートします。トランスフェクションの直後に、500マイクロリットルの室温E8培地を各キュベットに加え、トランセクトしたiPS細胞サンプルをDR4マウス胚性線維芽細胞を含む個々の10cm皿に滴下します。