in vitroでのsiRNA逆トランスフェクションベースの遺伝子サイレンシング:培養細胞に低分子干渉RNAを送達して標的遺伝子発現を不活性化する手順

改良された最小必須培地でsiRNAをピペットで混合し、室温で5分間インキュベートします。トランスフェクション試薬と改良した最小限の必須培地をsiRNAに加え、ピペットで混合します。室温で20分間インキュベートします。次に、トランスフェクションミックスをコラーゲンコーティングプレートの各ウェルに加えます。

100mmシャーレ内の細胞をDPBSで2回洗浄します。細胞に5倍のトリプシンを加え、トリプシンで全表面を覆うことを確認します。30秒待ってから、トリプシンを慎重に取り除きます。インキュベーター内でペトリ皿を37°Cで5〜10分間インキュベートします。

次に、皿をタップして細胞を切り離し、細胞の損傷を防ぎます。ピルビン酸を含まないDMEM10ミリリットル、グルコース25mM、FCS10%、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えて、トリプシンを中和します。培地を慎重に上下にピペットで動かして細胞を剥離し、細胞懸濁液を均質化します。

Malassezカウントチャンバーまたは自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、細胞の濃度を6.25 x 10⁵細胞/mLの培地に調整します。12ウェルプレートのウェルあたり800マイクロリットルの細胞懸濁液、またはトランスフェクションミックスを含む24ウェルプレートのウェルあたり400マイクロリットルの細胞懸濁液を播種します。

プレートを細胞培養インキュベーターでインキュベートし、24時間邪魔しないでください。翌日、上清をピルビン酸を含まない新鮮なDMEM、25 mMグルコース、10%FCS、1%ペニシリン、ストレプトマイシンと慎重に交換し、細胞をインキュベーターに戻します。