CRISPRコンカテマー媒介による複数遺伝子ノックアウト:マウス腸細胞における非相同末端結合経路により複数の遺伝子を同時にノックアウトする技術

この手順は、細胞懸濁液を含む15ミリリットルのチューブに9ミリリットルの還元血清培地を加えることから開始し、室温で400Gで3分間遠心分離します。すべての上清を取り除き、ペレットをエレクトロポレーション溶液に再懸濁します。合計10マイクログラムのDNAを2つの新しいチューブに加えます。次に、エレクトロポレーション溶液を最終容量100マイクロリットルに加え、細胞-DNA混合物を氷上に保ちます。

細胞-DNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットをエレクトロポレーターチャンバーに入れます。エレクトロポレーターの適切なボタンを押してインピーダンスを測定し、0.030〜0.055オームであることを確認します。テキストプロトコルに示されている設定に従ってエレクトロポレーションを実行します。400マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーとROCK阻害剤をキュベットに加え、その内容物をすべて1.5ミリリットルのチューブに移します。

室温で30分間インキュベートし、細胞を回復させます。30分後、400Gで室温で3分間遠心します。上清を取り除き、ペレットを地下マトリックスのウェルあたり20マイクロリットルに再懸濁します。48ウェルプレートにウェルあたり約1 x 10⁴〜1 x 10⁵細胞を播種し、EGFに加えてNoggin GSK-3阻害剤、ROCK阻害剤、および1.25%ジメチルスルホキシド培地を添加します。摂氏37度でインキュベートします。