一本鎖DNAを増幅するためのマイクロスフェアポリメラーゼ連鎖反応

Microsphere-PCRは、表面のオリゴヌクレオチドに結合したマイクロサイズの球体を使用するため、一本鎖DNAの優先的な増幅が可能になります。

マイクロスフェアPCRを開始するには、テンプレートの一本鎖DNA鎖、追加のヌクレオチドタグを付加したフォワードプライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTP、および一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを表示するマイクロスフェアを含む反応ミックスを取ります。

チューブをサーモサイクラーに入れ、定義された条件で運転します。

最初のサイクルでは、アニーリング温度で、テンプレートDNAがミクロスフェア表面のプローブに結合し、テンプレートDNAがセンス鎖として機能します。伸長中、ポリメラーゼはDNAを伸長させ、二本鎖はミクロスフェアに結合したままになります。

次のサイクルでは、変性中にテンプレートDNAがミクロスフェアから分離し、プローブ鎖が表面に結合したままになり、新しい鎖のテンプレートとして機能します。

アニーリング中、タグ付きプライマーはアンチセンス鎖に結合します。その後、ポリメラーゼはそれを伸長して、ヌクレオチドタグを持つセンス鎖を合成します。

このサイクルを数回繰り返すと、センス一本鎖DNAの複数のコピーが生成され、それが溶液に入りますが、二本鎖汚染物質は付着したままです。

PCR産物をローディングバッファーを含むチューブに移します。製品とマーカーをゲルの異なるウェルにロードし、アガロースゲル電気泳動を使用して分離します。

テンプレートDNAはかすかな低分子量バンドを形成し、強烈な高分子量バンドは一本鎖DNAの増幅を確認します。