Chip-in-a-TubeベースのデジタルPCRによる単一ヌクレオチドバリアントの定量

デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)は、ゲノムの特定の位置で一塩基を置換することで2つの塩基変異体または対立遺伝子が生じる突然変異である一塩基変異体(SNV)の定量化に有用です。

Chip-in-a-tube dPCR技術を使用して定量を開始するには、SNV(変異対立遺伝子と対応する野生型対立遺伝子)を含むDNAサンプルを採取します。耐熱性DNAポリメラーゼ酵素、dNTP、プライマーを含む混合物を添加します。

次に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ(対立遺伝子を区別するために異なる色の蛍光のレポーターで標識)とクエンチャー分子を添加します。クエンチャーがレポーターに近接しているため、その蛍光が抑制されます。

溶液をマイクロ流体チップの反応チャンバーに分割します。対立遺伝子を含む各チャンバーは、独立した反応容器として機能します。

チップの入ったチューブをサーマルサイクラーの中に入れ、反応を開始します。高温では、二本鎖DNAは一本鎖に変性します。温度を下げて、プライマーとオリゴヌクレオチドプローブをそれらの相補領域にアニーリングします。

適切な伸長温度で、DNAポリメラーゼはプライマーを伸長させ、プローブを切断します。クエンチャーからの距離により、レポーターの蛍光発光が可能になります。

異なる色の蛍光シグナルを読み取り、対立遺伝子を含むチャンバーを検出するための位置プロットを作成します。

変異型対立遺伝子の頻度(変異型対立遺伝子分画)を決定するには、変異体を含むチャンバーと野生型対立遺伝子の比率を計算します。