ウイルスゲノムを定量するためのドットブロットアッセイ

ドットブロットアッセイを使用してウイルスDNAを定量するには、まず単離されたウイルスDNA懸濁液から始めます。アルカリ性溶液で処理して、二本鎖DNAを一本鎖に変性させ、その後のハイブリダイゼーションを行います。

ドットブロット装置をあらかじめ濡らしたナイロンメンブレンで組み立てます。変性ウイルスDNAと直鎖状化した標準プラスミドDNA溶液をウェルにロードします。適切な真空を適用すると、負に帯電したウイルスの一本鎖DNAに効果的に転写され、静電相互作用を通じて正に帯電した膜表面に結合し、ドットパターンが形成されます。

分析後、メンブレンをクエン酸ナトリウムバッファーで洗浄し、アッセイ感度を向上させます。乾燥後、メンブレンを紫外線にさらし、ブロットしたDNAをメンブレンに架橋します。

加熱変性した非異種DNAフラグメントとウイルスゲノム特異的放射性リン標識DNAプローブ懸濁液をハイブリダイゼーションバッファーに添加します。インキュベートし、ハイブリダイゼーションを促進します。

DNA断片はブロッキング剤として作用し、残りの膜領域に結合し、非特異的プローブの結合を最小限に抑えます。放射性プローブは、ウイルス一本鎖DNA上の相補配列とハイブリダイズします。

洗浄バッファーで洗浄して、ハイブリダイズされていないプローブを除去します。蛍光体画像スキャンシステムを使用して、メンブレン上のウイルスゲノムにハイブリダイズされた放射性プローブから放出される放射性シグナルを定量化し、ドットブロットシグナルを取得します。

標準曲線から、メンブレン上の各ドットのシグナル強度を使用して、サンプル中のウイルスDNAの量を計算できます。