DNAメチル化の程度を決定するための5-メチルシトシンドットブロット

DNAメチル化は、DNAのシトシン塩基にメチル基を付加して5-メチルシトシンを形成するエピジェネティックな修飾です。この修飾により、遺伝子発現が変化します。

ドットブロットによるDNAメチル化の定量化には、さまざまな脱分化段階のヒト軟骨細胞に由来するゲノムDNAサンプルを採取し、メチル化シトシン

DNAサンプルを水酸化ナトリウム(強アルカリ)で処理し、加熱します。この処理により、2本のDNA鎖間の水素結合が切断され、DNAが変性します。酢酸アンモニウムを添加してアルカリを中和し、DNAの過度の分解を防ぎます。

ナイロンメンブレンを採取し、変性したDNAサンプルを点として見つけます。負に帯電したDNAは、静電相互作用を介して正に帯電したナイロン膜に結合し、固体支持体にブロッティングします。

ブロットしたメンブレンをブロッキングバッファーで処理し、非特異的結合を防ぎます。次に、抗5-メチルシトシン抗体をメンブレンに添加し、インキュベートします。これらの抗体は、DNA上のメチル化シトシンにのみ結合します。

洗浄して未結合の抗体を取り除き、一次抗体に特異的に結合する化学発光酵素標識二次抗体を添加します。

膜上に化学発光基質を添加します。抗体上の酵素が基質と反応して化学発光を生じ、さまざまな強度のドットが生成されます。

メンブレンを画像化し、各サンプルのDNAメチル化の程度に対応するドットの強度を測定します。